流式必备设门技巧

完成了完美的染色和流式细胞仪运行后，艰苦的工作开始了 ——数据分析。为了正确地识别目的细胞，需要综合生物知识和流式操作经验，才能正确的圈出表示最终结果的目的区域。设门是一个全有或全无数据减少处理。将门内细胞内移动到下一个分析要点，而同时门外的细胞即通过像素，也被排除在外。

1. 尽可能多地了解目的细胞群体

在开始之前，尽可能多地了解目的细胞群体。虽然这听起来比较草率，知道实验主要要用哪种细胞是非常重要的。

参考文献中这些细胞检测的方法，或通过以往的经验指导实验。分析数据首先确定所选染色和对照组是否恰当。

2. 细胞大小并不代表一切

细胞大小并不代表一切。通过前向和侧向散射门来区分其他细胞和淋巴细胞，这种方法不大可靠。胀满的淋巴细胞比静息细胞大，如果设门靠近 FSC/SSC，这些细胞可能被错过。

最好是使用散点图来排除图中左下角的碎片，以及那些 FSC 小和 SSC 复杂的固缩细胞碎片。或者可做到更好，通过 FSC 和活性染料门比较。这显然可在分析中消除死细胞和碎片。

3. 检测上机时的稳定性

检测上机时的稳定性，选取一个散点图观察上机的流速均匀性。通过这样一个图可排除上机操作不当的人为误差。

下面的图，左边的图流速均匀，右边的图流速控制不好。

4. 双峰的消除

如下图所示，细胞团块该图所示，当它们通过激光截距，将比单个细胞长。这反过来又影响了信号的区域。使用脉冲几何门（如 FSC-H x FSC-A），双峰可以容易被消除。

5. 通过对照组引导

实验中的对照组对于确定被检测的细胞至关重要，例如，一个 FMO 对照（空白对照），在多色实验中，用于确定门的正确位置是至关重要的。局限于配色方案中的荧光染料作用，细胞的散布不能使用同型对照校正。如下所示，红圆圈中的细胞代表了在该散布区域，因此应排除。然而为了充分优化该配色方案，明智的做法是使用亮度更高的抗体。若是没有 FMO 对照，这些细胞将被包括在分析内。

6. 利用反向设门

在设门方案中假设感兴趣的门不能使用，可用反向设门工具检测数据，以确定哪些细胞将落于最终群体，

在第三个图中，假设不使用设门，将有大量细胞被包括在最终的门。知道这些细胞是阳性的存活标记可帮助确定门的位置。

编辑： weicf    来源：丁香园