也许你并不了解 GFP、FITC 和 PE

如果你不了解 GFP、FITC 和 PE，你可能发表错误的流式数据。

当我们学习荧光素的时候，学到的第一点知识就是荧光素的发射波长比他们的吸收波长要长。

需要特别指出的是斯托克位移（stokes shift），斯托克位移对荧光素发光过程中非辐射能量的转移进行了总结。当荧光素分子吸收光子的时候，一些吸收的能量在分子震动和运动（或者其它）中丢失，因此荧光后释放的能量比分子吸收的能量要低。因为波长和能量成反比，所以发射光的波长比吸收光的波长要长。

按照激发和发射光谱检查荧光素是非常有必要的，这从本质上表明了分子以某个特定波长发射的光子所产生激发光子波长的概率。图 1 阐述了 FITC 在 488 nm 激发波长下的激发光谱和发射光谱。

FITC 的发射峰在 530nm 左右。这意味着如果我们激发这个分子，很可能这个分子会发射绿色的光。因此，我们选择流式细胞仪上的带通滤波器，使得光谱集中在这部分区域（如 525/30），以便在发荧光过程中捕获尽可能多的光子。

然而，FITC 的发射光不仅限于是绿色的，也可以发射黄色，橙色，红色的光，虽然这些光的概率很低。

如果在激发后立刻查看发射曲线，你会注意到一些很有意思的事情。可能会出现发射的光子波长低于激发的光子波长的情况，尽管出现的概率很低。这就表明分子发射出的光子能量比吸收的光子能量要高。

这是否代表我们得到的能量比我们给分子的能量还要多，同时也违反了能量守恒定律呢？

PE 在两个不同激发波长下的光谱如图 2，更是咄咄逼人地解释了这个现象。

PE 比 FITC 有更为复杂的激发态，它有两个激发峰，一个在 488 nm，另一个在 561 nm 附近。有意思的是，在 561 nm 下观察到发射光子能量大于吸收光子能量的机会更大。

这怎么会不与一些我们常见的规则相悖呢（如能量守恒定律）？

答案很简单：这些分子自己提供能量

按照 Howard Shapiro 在《实用流式细胞术》的 113 页中所写：

「你可能会说，好的，但是激发光谱遮挡了发射光谱。如果不管激发波长是多少而发射光谱保持不变，那是不是就意味我们可以在 510 nm 波长激发下得到 500 nm 波长的发射光谱，但这看起来违反了能量守恒定律？实际上，如果当 510 nm 激发光子到来时，分子已经处于震动激发态，我们可以在 510 nm 波长的激发下得到 500 nm 波长的发射光谱，电子激发消耗的能量是不改变的，但是分子本身会提供一些能量」

实际情况就是这样，这种奇怪的、普遍误解的现象是真实的，最重要的是它不违背物理定律。

当检测 PE 同时检测 FITC 时，尤其是使用宽的过滤器（如 525/50 BP 代替 525/30 BP）的时候，你可能会在你的流式数据中注意到这个现象。你在 FITC 检测时看到的任何 PE 信号都与激光光谱无关，也就是说，不管你是使用 488 nm（此时发射光谱比激发光谱长）或者使用 561 nm（此时发射光谱比激发光谱短）激发光谱激发 PE，你都会看到这个信号。

注意：这个现象只会在 488/561 的共线系统中观察到，在这样的系统中激光器中发射的光都被收集到同一个光路中。而多斑点或者多小孔的设备不具备 FITC 检测器。

实际上，在 561nm 激发比在 488nm 激发能看到更多的信号，这是因为 PE 分子在 561nm 比在 488nm 处能更有效的激发。更关键的是，发射曲线的形状与激发波长是无关的。

因此，「荧光素发射的光子高于他们吸收的光子」这个描述实际上是错误的。

更加准确的描述应该是「荧光素的发射光子是根据它们的发射光谱决定的，发射光谱的最大值转换到比激发波长更高的波长」。 这个现象提醒我们荧光素比我们平时所认为的更为复杂，也因此更加有意思。

编辑： weicf    来源：丁香园