揭秘特辑二 | 外泌体从实验室到应用的关键一步： 从认识外泌体开始

 

外泌体分离技术，从认识外泌体开始

在生物医学研究的前沿，外泌体正逐渐成为连接基础研究与临床应用的桥梁。这些微小的细胞外囊泡，携带着丰富的生物信息，不仅在细胞间通讯中扮演着重要角色，还在疾病诊断和治疗中展现出巨大潜力。然而，要将外泌体从实验室推向临床，分离与表征技术是必须攻克的关键环节。

今天，就让我们深入探讨外泌体分离方案的起点---从认识外泌体开始，详细剖析外泌体的细化性质和组成，做有的放矢之人。

有一句名言“欲使其灭亡，必先使其疯狂！”

哈哈，错了，再来！

开玩笑了

在分离纯化领域，有一个共识：只有充分了解物质，才能更好地纯化它。特别需要了解其理化性质与杂质的差异。

 

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认识外泌体

外泌体是细胞内的一种特殊结构——内质网逐渐成熟，变成多泡体（MVBs），多泡体内部充满了由内质网膜向内凹陷形成的内腔小囊泡（ILVs），这些ILVs就是外泌体的前身。

外泌体形态、大小、密度、带电性质

外泌体是具有膜结构的球状或杯托状小囊泡，大小通常在30-150nm之间，当然也有定义30-100nm或者30-200nm的。

个人意见：不管外泌体定义为多大，反正具有大小异质的，那么就选择30-200nm吧，正所谓选大不选小，就算这么任性。

这些不同的尺寸范围使得它们在细胞外环境中具有不同的物理和化学特性，也影响了它们在生物体内的分布和功能。外泌体的形态通常是圆形或杯状，相对较为均一。

外泌体的密度在1.10-1.21g/cm3之间，凋亡小体的密度则在1.16-1.28g/cm3之间。这些密度差异也反映了它们在细胞外环境中的沉降特性和分离难度。

外泌体在中性条件下，整体带负电荷，其zeta电位一般在-10~-50mV。

细胞外囊泡（EVs）的识别特性。显示了外泌体、微囊泡和凋亡小体的主要物理和生化特性，包括离心速度、密度、直径、形态和蛋白质标记物。这些信息对于选择合适的分离方法和验证分离结果非常关键。例如，外泌体通常需要较高的离心速度来分离，而微囊泡和凋亡小体则需要较低的离心速度。此外，不同的蛋白质标记物可以帮助区分这些细胞外囊泡，确保分离的纯度和准确性。

外泌体组成

外泌体携带着来自母细胞的脂质、蛋白质和核酸等物质。

外泌体的蛋白质组成

外泌体的蛋白质组成相对较为复杂，大约10^9个外泌体中可以提取出大约1微克的总蛋白。这些蛋白质在外泌体的生物发生、细胞间通讯以及疾病发生发展过程中发挥着关键作用。

外泌体的蛋白质组学研究已经揭示了许多与外泌体生物学功能相关的蛋白质。例如，外泌体膜上常见的四跨膜蛋白家族成员CD9、CD63和CD81等，它们在细胞间的信号转导、细胞黏附以及细胞迁移等过程中具有重要作用。

此外，外泌体还含有与细胞凋亡相关的蛋白，如Hsp70和Hsp90等，这些蛋白在外泌体的稳定性和功能维持中也发挥着关键作用。

外泌体的脂质组成

外泌体的脂质组成也具有其独特性。研究表明，外泌体膜中富含胆固醇、鞘磷脂和神经酰胺等脂质，这些脂质的含量通常高于母细胞膜中的相应脂质含量。这种特殊的脂质组成使得外泌体具有较高的稳定性和刚性，能够在细胞外环境中长时间保持其结构和功能完整性。

外泌体的脂质组成不仅影响其物理特性，还与其生物学功能密切相关。例如，外泌体膜上的磷脂酰丝氨酸可以作为“吃我”信号，被巨噬细胞等吞噬细胞识别并吞噬，从而在外泌体的清除和细胞间通讯中发挥重要作用。

外泌体的核酸组成

外泌体的核酸组成也具有其独特性。外泌体中含有丰富的miRNA和mRNA，这些核酸分子可以被受体细胞摄取并发挥调控作用。

例如，外泌体中的miRNA可以通过与靶mRNA的结合，抑制其翻译或促进其降解，从而调节受体细胞的基因表达。

外泌体中的mRNA则可以在受体细胞中被翻译成蛋白质，从而影响受体细胞的功能。

外泌体的核酸组成反映了母细胞的生理状态和病理状态，因此可以作为疾病诊断和预后的潜在生物标志物。外泌体的这些特性使其在细胞间通讯中扮演着重要角色。它们可以将母细胞的信息传递给靶细胞，调节靶细胞的生理功能。

外泌体的表面性质

在外泌体的表面，存在着一些特定的蛋白质，它们就像是外泌体的“身份证”。

例如CD9、CD63和CD81等四跨膜蛋白，它们通常存在于外泌体的膜上，参与膜的融合、信号传递以及蛋白质的运输等过程。

ALIX、flotillin和TSG101等蛋白质也与外泌体的形成密切相关。

此外，ESCRT复合体以及相关的Hrs、flotillin、TSG101和ALIX等蛋白质，它们在多泡体的形成和内腔小囊泡的吞噬过程中起着关键作用，也是外泌体中常见的蛋白质成分。

Rab27a和annexin等蛋白质则参与了多泡体与细胞膜的融合过程，调节外泌体的分泌。

细胞骨架蛋白如肌动蛋白和肌球蛋白，以及热休克蛋白如Hsp70和Hsp90等也在外泌体中富集。

这些蛋白质不仅作为外泌体的标记物，帮助我们区分外泌体与其他细胞外囊泡，还被广泛应用于外泌体的检测和分离。

 

外泌体、微囊泡和凋亡小体的生物发生途径和生化组成。A. 外泌体：外泌体的蛋白质（CD9、CD63）、MVB（含有ILVs）、鞘磷脂、胆固醇、早期内质网、神经酰胺、MHC-I/II、TSG101、Rab27a、ALIX、肌动蛋白、Hsp70等。B. 微囊泡：微囊泡的蛋白质（CD40、整合素、糖蛋白Ib、P-选择素）、膜蛋白、磷脂酰丝氨酸、C3b、TSP、组蛋白、CNX、CRP55等。C. 凋亡小体：凋亡小体的蛋白质（CRP55、CNX、C3b、TSP受体）、膜蛋白、磷脂酰丝氨酸、组蛋白、核糖体等。

 

 

总结

 

清楚认识外泌体，了解其理化性质与组成，对外泌体的分离纯化是不是就简单很多了呢？可以试着来扒一扒，举几个栗子：

1. 外泌体尺寸大小在30-200nm，那么就可以采用基于分子大小的分离方案，例如超滤、尺寸排阻等。

2. 外泌体的密度在1.10-1.21g/cm3，可选的分离纯化方法包括差速离心、密度梯度离心等。

3. 外泌体在中性条件下带负电，是不是就能按阴离子或阳离子交换的方案呢。

4. 外泌体具有特异性表面标志物，如果使用分离纯化领域的亲和捕获法，可以极大提高外泌体纯化效率。

以上是根据外泌体的理化性质，可选择的分离方案，当然可以多种方法联用，这样就能获得的极高纯度和质量的产品。