CRISPR Screen——大规模、高效进行“靶点研究” 的关键技术

CRISPR screen也称为全基因组CRISPR，或者高通量基因编辑技术，是基于CRISPR-Cas9系统，通过构建sgRNA文库同时对多个活性细胞的不同基因进行基因敲除或激活，辅助以特定的筛选方案，通过NGS测序和生信分析的手段，预测出符合条件的候选基因。根据其技术特点，可广泛应用于以下研究方向。

在进行CRISPR screen研究时，根据筛选环境的不同，CRISPR screen有三种模式：体外筛选（细胞筛选）、基于细胞的体内筛选、基于AAV的体内筛选，不同模式的实验设计方案也有所不同。以体内筛选为例，样本选取可选择侵染前的细胞样本，不同时期及不同部位肿瘤组织（早期原发灶、晚期原发灶、转移灶）。

而根据筛选目的的不同，CRISPR screen又可分为另外的两种模式：

• 在一定的筛选压力存在时，如无外在因素干扰，仅有少数细胞能够存活的筛选系统，如抗肿瘤药物的耐药性筛选。

• 在对药物耐药性研究中，通过干扰细胞中基因的表达，使其获得生存。在后续的结果分析中，解析存活细胞中富集的 sgRNA，进而获取与细胞耐药性相关的基因。

• 无对照组也可做。

• 最终是鉴定出引起细胞某些功能缺失的基因，如寻找与肿瘤细胞生长相关的基因。

• 通过比较不同筛选时间点（如筛选起始的时间点和筛选结束的时间点）的 sgRNA 丰度差异，获得缺失的 sgRNA，分析其所对应的基因。这些基因便是可能影响细胞生长的候选基因。

• 多个处理组，需要对照。

CRISPR screen技术流程包含以下内容：

1. sgRNA文库设计好后进行合成，构建慢病毒质粒文库。通过NGS测序对质粒文库进行质控，分析文库的覆盖度和均一性。

2. 通过高通量测序技术统计每一种sgRNA的reads富集数，比较组间sgRNA差异表达，筛选出与耐药性、生长或增殖相关基因。

CRISPR Screen技术在筛选功能基因方面，具有效率高、准确性高、性价比高等优点，可以“一次性”挖掘大量的“靶标信息”，极大促进了肿瘤进化机制、靶点筛选、药物研发、联合用药指导、肿瘤耐药、药物作用机制等方面的研究。

溶酶体Rag-Ragulator复合物调控RIPK1和caspase-8介导的细胞焦亡

The Lysosomal Rag-Ragulator Complex Licenses RIPK1 and Caspase-8-mediated Pyroptosis by Yersinia

发表期刊：Science

发表时间：2022年1月19日

宿主细胞启动细胞死亡程序来限制病原体感染。巨噬细胞中致病性耶尔森菌对转化生长因子-β-活化激酶1 (TAK1)的抑制可触发受体相互作用的丝氨酸-苏氨酸蛋白激酶1 (RIPK1)-依赖的Caspase-8切割gasdermin D (GSDMD)和炎症细胞死亡(细胞焦亡)。通过Caspase-8依赖性细胞焦亡介导因子的全基因组CRISPR screen，研究人员确定了溶酶体卵泡素（FLCN）-卵泡素相互作用蛋白2（FNIP2）-Rag-Ragulator超级复合物的意外作用，该复合物可调节代谢信号和哺乳动物雷帕霉素靶蛋白复合物1（mTORC1）。

在对耶尔森菌感染的反应中，FADD、RIPK1和Caspase-8被募集到Rag-Ragulator中，导致RIPK1磷酸化和Caspase-8激活。焦亡激活依赖于Rag GTPase活性和Rag-Ragulator的溶酶体系缚，而不依赖于mTORC1。因此，溶酶体代谢调节因子Rag-Ragulator指导对耶尔森菌的炎症反应。

在耶尔森菌感染过程中，Rag-Ragulator作为一个功能性平台招募并激活RIPK1与caspase-8，进而触发GSDMD的剪切活化及随后的细胞焦亡

链球菌热原外毒素B切割激活GSDMA并引发细胞焦亡

Streptococcal pyrogenic exotoxin B cleaves GSDMA and triggers pyroptosis

发表期刊：Nature

发表时间：2022年2月2日

A族链球菌（Group A streptococcus，GAS），又称化脓链球菌（Streptococcus pyogenes），感染后临床严重程度与其链球菌热原外毒素B（SpeB）表达量呈显著负相关，但具体分子机理尚不清晰，为了明确其相关机制，作者进行了如下研究：

利用GAS小鼠皮肤感染模型，比较野生型及不同毒力因子缺失GAS菌株致病能力。与野生型及其他毒力因子缺失菌株感染后出现的严重化脓和坏死性病变相比，SpeB缺失GAS菌株感染后感染部位未观察明显皮肤溃烂且中性粒细胞明显减少；同时，小鼠表现出更严重的系统性感染和死亡。

通过原代皮肤角质细胞GAS感染实验发现，GAS SpeB的缺失使其丧失诱导细胞焦亡样细胞死亡的功能，并促进其系统性感染。利用全基因组CRISPR screen技术，筛选鉴定出SpeB诱发皮肤上皮细胞焦亡的关键蛋白GSDMA。

SpeB特异性剪切GSDMA（而非Gasdermins家族其他成员），产生约27kDa的N-末端片段并诱导细胞焦亡；Edman测序和质谱分析发现SpeB切割GSDMA第246位氨基酸；胞内导入体外纯化的GSDMA 1-246aa片段可直接诱导细胞焦亡；脂膜试纸条和脂质体结合实验揭示GSDMA 1-246aa能够与细胞膜磷脂以及含有相应磷脂的脂质体结合；脂质体泄漏实验证明GSDMA 1-246aa能够在特定脂质体上成孔；序列比对结果显示该剪切位点在小鼠Gsdma1中保守；SpeB诱导的Gsdma1切割可诱发小鼠上皮细胞焦亡；小鼠GAS感染部位可检测到Gsdma1剪切；相比于野生型小鼠，Gsdma1的敲除使其对GAS感染更加敏感。

参考文献：

[1] Zheng Z , Deng W , Bai Y ,et al.The lysosomal Rag-Ragulator complex licenses RIPK1- And caspase-8-mediated pyroptosis by Yersinia[J].Science, 2021, 372(6549):eabg0269.DOI:10.1126/science.abg0269.

[2] Deng W , Bai Y , Deng F ,et al.Streptococcal pyrogenic exotoxin B cleaves GSDMA and triggers pyroptosis[J].Nature, 2022(602-Feb.17 TN.7897).DOI:10.1038/s41586-022-05109-x.