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实验问答

26,707,972 科研人在看

问Western与RT-PCR的区别？

tao0129

这只是从不同的角度来分析，Western研究的是蛋白表达水平，RT研究的是转录水平，尽管二者都是研究基因表达的。但有一定差别，转录水平不完全等同于蛋白表达，因为它没有考虑到转录后调节的问题。但RT有一个好处，只有有序列就可以做，不象Western必须有抗体。并且RT可以研究同一基因不同亚型的表达，而同一蛋白亚型通常有多种基因型。选择哪一种须根据你的目的而言，能两种都做当然好，但有时候也会出现不相一

2 回答2218 围观

问PCR引物的设计原则是什么？

赵栋2012

1. 引物最好在模板cDNA的保守区内设计。2. 引物长度一般在15~30碱基之间。3. 引物GC含量在40%~60%之间，Tm值最好接近72℃。4. 引物3′端要避开密码子的第3位。5. 引物3′端不能选择A，最好选择T。6. 碱基要随机分布。7. 引物自身及引物之间不应存在互补序列。8. 引物5′端和中间△G值应该相对较高，而3′端△G值较低。9. 引物的5′端可以修饰，而3′端不可修饰。10

1 回答3023 围观

问western blot 可以同时加两种以上的一抗吗？

tao0129

最好还是不要同时加两种一抗。因为如果结果里面有非特异信号的话，就说不清楚了。做Western在同一张膜上检测目的蛋白和内对照，也是先上目的蛋白的一抗、二抗，ECL显色、压片、洗片；漂洗以后，再上内对照的一抗、二抗，ECL显色、压片、洗片。

1 回答4998 围观

问在 WB 实验中，使用 TBS 和 PBS 的区别？

赵栋2012

选择合适的缓冲液对于维持一定pH值下蛋白质的稳定及保证实验的重复性是很重要的。PBS的缓冲能力强于TBS（因为混合缓冲液在一定的离子强度下常常具有更宽的缓冲范围），TBS在pH7.0 以下缓冲能力较弱（不过PBS易污染）。但我们常常要根据我们实验目的选用合适的缓冲液，如在蛋白纯化中进行阴离子交换层析，阳离子缓冲液首选TBS；阳离子交换层析时，阴离子缓冲液则首选PBS。

1 回答11036 围观

问Western Blot 中抗体反复冻融会影响结果吗？

赵栋2012

wandrer战友回答：抗体工作溶液一般不主张储存反复使用，但是如抗体比较珍贵，可反复使用2－3次。稀释后应在2－3天内使用，4度保存，避免反复冻融。

1 回答4813 围观

问Western Blot 实验如何选膜？PVDF 膜还是 NC 膜？

tao0129

PVDF膜价格较贵，可重复使用，特别适合蛋白印迹，结合能力较强，但价格比较昂贵。 NC膜价格比较便宜，应用较广，结合牢固性差一些，韧性也不如PVDF，不能重复使用，但蛋白吸附容量高，亲水性较好。两者都可以用丽春红染色。具体使用还要参考相关文献。

1 回答1750 围观

问固定在玻片上的细胞在保存后能否再用？

tao0129

如需要，可将有固定化细胞的玻片放在70%的乙醇中，-20℃保存2周。

1 回答1365 围观

问为什么会产生弥散（smear）条带？

tao0129

原因：在PCR反应体系中第一链产物的含量过高。解决办法：1.减少引物的用量。2. 优化PCR反应条件/减少PCR的循环次数。3. 在用DNase处理被DNA污染的RNA样品时，其产生的寡核苷酸片段会产生非特异性扩增，一般会显示为弥散背景。

1 回答4957 围观

问PCR 实验的扩增曲线为什么呈现直线型？

tao0129

原因：1.探针部分降解。探针降解原因：（1）探针反复冻融――稀释的探针可在4℃保存至少3个月，应避免反复冻融。（2）探针在光线下暴露时间太长。2.反应液中有PCR抑制物。

1 回答1607 围观

问WB 实验中为什么我的条带会跑得比正常的窄？

赵栋2012

drake015战友回答1. 可能因为胶凝的不均匀，聚合的不是很好，灌胶的时候尽量混匀。2. 是不是有窄有宽？可能与你拔梳子的时候有关，拔梳应该迅速，冲洗加样孔的时候要小心，以免把上样带扭曲；胶配好了用枪吹几下再灌胶，还有就是要等指示剂跑到两层胶交界成一线时，再调高电压。3. 可能是你样品的问题，如果盐浓度较高，便会挤压其它条带，致使条带宽窄不一，由于同样的原因，样品在凝胶中的速度会很慢，造成条带

1 回答3090 围观

问PCR 时变性时间 15s 退火时间 15s 是否会对结果产生影响？

丁香通官方号

引物与PCR大小无关，基本上引物在20-30 bp。

1 回答2105 围观

问扩增产物滞留在加样孔中了怎么办？

tao0129

1. 有可能是由于模板量过高而导致PCR结果产生了高分子量的DNA胶状物。建议将第一链结果至少稀释100倍再进行二次扩增。2. 另外，在二次PCR时使用的退火温度如果比引物的Tm值低5℃，可以将退火温度适当增高或进行热启动以提高特异性。

1 回答1531 围观

问扩增产物在电泳分析时没有条带或条带很浅？

tao0129

1.最常见的原因在于您的反应体系是PCR的反应体系而不是RT-PCR的反应体系.2. 与反应起始时RNA的总量及纯度有关。3. 建议在试验中加入对照RNA。4.第一链的反应产物在进行PCR扩增时，在总的反应体系中的含量不要超过1/10。5. 建议用Oligo(dT)或随机引物代替基因特异性引物（GSP）用于第一链合成。由于RNA模板存在二级结构，如环状结果，有可能导致GSP无法与模板退火；或SSⅡ

1 回答2446 围观

问PCR后没有目的核酸条带？

小坏2012

1.看看你用的引物适不适合做cDNA的扩增，不要用扩增DNA的引物扩增cDNA。2. 拿到cDNA后做扩增之前，最好做一个阳性对照，看看你的扩增体系工作如何。3. 当然非常少见了，如果你的扩增体系工作的，就是说你的试剂都work的，那么就要考虑你的仪器是不是工作的，有时候PCR仪永久了不维修会有这种情况发生。

1 回答1247 围观

问为什么要使用基因特异性引物？

tao0129

GSP在扩增低丰度的转录本时是最好的。OligodT引物建议用于高质量RNA及全长转录本的逆转录；随机引物用于mRNA片段的逆转录。

1 回答2587 围观

问阴性对照或空白对照翘尾

tao0129

原因：1. 模板提取环境有污染。2. 模板提取操作有污染。3 试剂配制过程存在污染。

1 回答3644 围观

问DNA 纯度的判断根据 OD260/OD280 的比值判断，在什么范围是最佳？

小坏2012

符合要求纯度高的纯化DNA其OD260/OD280在1.6~1.8之间，低于此范围表明蛋白质含量超标，高于此范围表明样品中含有RNA。一般机器给出的比值是分子分母同时减OD320所得，你可以自己算一下OD260/OD280，如果在要求的范围内，说明你的OD320偏高，即可能有有机物污染，比如酒精未充分挥发。纠正一下，纯DNA的A260/A280应大于1.8，纯的RNA应达到2.0，样品中如果含有蛋

1 回答5184 围观

问石蜡切片和冰冻切片的比较？

tao0129

1.要求做冰冻切片的不一定能做石蜡切片，因为作石蜡切片时要高温烤片，可能会破坏组织的抗原性，如果组织的抗原性较稳定，则可作石蜡切片；但是要求做石蜡切片的，可作冰冻切片。2. 冰冻切片的优点是能够较好的保存组织的抗原免疫活性，做免疫组化时不需抗原修复这一步。缺点是细胞内易形成冰晶而破坏细胞结构，可能会使抗原弥散；切片厚度较石蜡的厚，做的片子没石蜡的漂亮。当你买一抗时，目录上都写着做什么样的切片，如果

1 回答4345 围观

问WB 实验结果为什么出现了多条带？

tao0129

一抗、或二抗抗体浓度太高，多克隆抗体本身的非特异性反应，抗体的特异性不强，目的蛋白经过处理后发生变化，而内参的条带基本均匀一致。这样才有说服力，表明的确是处理因素造成目的蛋白的变化而不是加样误差或认为的造成目的条带浓度的变化，所以严格意义上说，内参是必须做的。

1 回答5273 围观

问半干转是否要求膜，滤纸，胶同样大小？

tao0129

可以相等，但是如果纸、膜比凝胶大就比较容易形成短路了，上下两层虑纸也不能因过大而相互接触，这样同样会短路，电流不会通过胶和虑纸。转移前和转移过程中看看电压就行，正常的半干是慢慢变高的，最后结束时一般是开始的1.5~3倍都是正常的。一般Buffer和滤纸选的对就不会短路。

1 回答2739 围观

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