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问
关于 PHA 刺激 PBMC 增殖,用 CCK-8 检测 ,实验孔 OD 值却不稳定是为什么?
roby_0_0_2000
你的PHA-p 5ug/ml就可以了,浓度大了自然会死。死于过度刺激。还要加IL-2,不加会死的。
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问
蛋白质免疫印迹一1抗2抗用什么稀释更好?
蜻蜓美女
1,我们实验室是用牛奶加TTBS稀释的,但是磷酸化的抗体一般是BSA加TTBS,效果很好。2,我们实验室是用水。希望对你有帮助
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问
WB转膜曝光后少样本是为什么?
phhcrab
你是用传统胶片曝光的还是化学发光成像?每次都出不来的是同一个泳道的吗?如果每次都是固定的位置出不来,是不是可以检查一下实验硬件?
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问
WB 没有看到条带是什么原因?
Neuron_Glia
若抗体中有防腐剂,如叠氮钠,会使荧光猝灭;另外,荧光越强,淬灭越快。但是你看不到条带,最可能的原因还是抗体效价较低或浓度不足。
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问
我最近做western的内参条带特别好,背景也很干净,但是目标蛋白要么没有条带,要么有条带但是背景很脏,为啥呢?
我是金博士
1、内参与目的蛋白用的是相同的二抗吗?2、洗膜3min,5-6次3、背景高,调整二抗浓度4、时有时无,请在转膜后用丽春红染膜
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问
目的带做出来了,但是为什么膜的内参一直都没跑出来?
我是金博士
1、样品中无内参蛋白表达。 2、内参不能识别你检测的种属的样品?
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问
请问客养的小分子量蛋白的转膜条件 OK 吗?
xuxian1225
完全可以,我做的蛋白就是11k的,100V转120分钟都没问题,90分钟对这么小的蛋白足够了。
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问
Native Page 为什么样品的下段都不见蛋白条带?
我是金博士
你的胶做得不太好啊,marker都分不开。你要是想知道条带少,是上样量少了还是降解了,可以做个上样量梯度,一般都会做个预实验,看看浓度。
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问
蛋白提取总是出现问题?
我是金博士
1、50-100ul,看细胞沉淀的多少而定2、细胞太少了?细胞中DNA含量比较大,如果有条件,用超声处理一下就好了
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问
胶片定影之后显得有点暗,不够清亮是不是定影液的问题呢?
我是金博士
显影液的问题,10%与12%的胶跑出来的marker位置是不一样的。
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问
WB 结果的内参非常好,既没有背景条带也亮,而目的就不行,不是没有条带就是背景很高,这又是什么原因呀?
我是金博士
1、任何一个公司的抗体都不是百分之一百的。我认为CST的抗体成功率是目前最高的2、表达量的多少可以看看文献3、CST说明书用的是什么细胞作为抗原呢?如果你手上有可以做个验证。看是否你做的细胞表达少
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问
假如 模板DNA中混有杂蛋白 是不是就扩增不出来
我是金博士
你的DNA模版是怎么提取的呢?有没有进行过处理?扩增没成功,有很原因,杂蛋白的影响也要看情况,一般试剂盒都能去掉的。
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问
为什么用四氯萘酚和 DAB 结合显色后,出现非常多的非特异性条带,而且背景显色一片?
我是金博士
1、直接DAB显色不行吗?2、二抗好像效果不好哦3、先直接用DAB试试,另外确认二抗没有带出来非特异性条带
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问
WB一抗二抗配好后4℃保存能多久?一个月怎么样?
我是金博士
1、一抗4度可以在一周左右,加一点NaN3二抗现用现配!且不可加NaN3丽春红不会影响,染完直接封闭,封闭后丽春红就没了。2、一抗是什么?二抗还需要孵育过夜?3、先把内参做好
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问
显影时背景很黑,我就洗了两天膜,然后又显影了一次,这次是白片?
我是金博士
最好stripping一下,背景很黑的话需要调整一下二抗浓度。
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问
如何确定普通反转录 PCR 时 cDNA 的用量?
苏格兰白草莓
必须要保证cDNA的量要一致才有可比性,所以最好还是做RT-qPCR。之所以要做内参,一是利用△△C法运算得到基因差异,二就是利用内参可看得出你每孔的cDNA模板量是否具有一致性,一般来说,我们实验要求样品内参的Ct值最好相差不要超过0.2~0.5,还有值得注意的是,如果内参Ct值出现过大或者过小都会影响到你的实验数据分析,一般来说内参在Ct值=12~15的位置左右为宜
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问
我在做Western Bloting时,加ddH2O稀释成,不知有影响吗?
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问
想保证上样量一致,那么调浓度时用什么溶剂稀释蛋白浓度呢?
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问
我用的预染marker,转膜时发现完全没有转到膜上,但是胶上也没有marker,这是什么原因呢?
我是金博士
1、这个正常,转膜结果到底如何需要染膜来看膜上的蛋白 2、不能这样来确定 3、这个很奇怪,没碰到,看看你做的三明治是否成功,仪器是否有问题 4、与电压之类是有关系,但是不应该2个泳道的marker,一好一坏
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问
虽然阳性样品能染出条带,但以前阳性质粒也没做出来,可能不会是转膜时间问题?
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