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实验问答

28,850,168 科研人在看

问请问 PCR 程序最后给出的 RQ 值是否可以直接用来统计？

qianliu185676911

PCR反应中,CT值是指每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数；RQ值是比较的Ct值。它经过数学公式变形而来。它是判定实验样品中目标靶位点与在标准样品中相同靶位点的表达变化情况。

1 回答6767 围观

问请教几个问题，大鼠在颈总动脉给药后，拔出针头后必须结扎该颈总动脉吗？这之后能够存活吗？

ahan

如果是直接在大鼠体表进针，需消毒好进针部位，进针后可以直接按压，按压时间5-15分钟，自己摸索。如果是大鼠劲总动脉暴露后给药，可能需另当别论。个人之见，仅供参考

1 回答1517 围观

问关于 PHA 刺激 PBMC 增殖，用 CCK-8 检测，实验孔 OD 值却不稳定是为什么？

roby_0_0_2000

你的PHA-p 5ug/ml就可以了，浓度大了自然会死。死于过度刺激。还要加IL-2，不加会死的。

3 回答4619 围观

问蛋白质免疫印迹一1抗2抗用什么稀释更好？

蜻蜓美女

1，我们实验室是用牛奶加TTBS稀释的，但是磷酸化的抗体一般是BSA加TTBS，效果很好。2，我们实验室是用水。希望对你有帮助

11 回答8620 围观

问WB转膜曝光后少样本是为什么？

phhcrab

你是用传统胶片曝光的还是化学发光成像？每次都出不来的是同一个泳道的吗？如果每次都是固定的位置出不来，是不是可以检查一下实验硬件？

4 回答2713 围观

问免疫组化结果与文献相反是为什么？

yqc127

这可能要从两方面考虑：1. 自己的主观原因，可能是自己实验操作的问题；如果自己的问题感觉不大，也可能是抗体特异性的问题，可以看看有没有相关的文献也用了类似的抗体，进而一步步查找问题。2.标本的客观问题，由于不知道有没有可能你的标本是一个有别于文献报道的特例？还是文献报道的情况是有限制范围的？这要自己斟酌。即使是同一样本，由于存在取材，保存，处理等多方面的差异也可能导致最终的结果的不同。

3 回答3841 围观

问目的基因mRNA表达量一定会比GAPDH低吗？

tntztyx

可以在NCBI看一下spc的基因表达特异性

2 回答3189 围观

问WB 没有看到条带是什么原因？

Neuron_Glia

若抗体中有防腐剂，如叠氮钠，会使荧光猝灭；另外，荧光越强，淬灭越快。但是你看不到条带，最可能的原因还是抗体效价较低或浓度不足。

3 回答2366 围观

问原核表达在包涵体里，该这么提蛋白做纯化呢？

丕龙兄

1.蛋白在包涵体里很常见，原因也很多，你可以尝试一下其他的解决方案。比如说降低诱导温度，更换表达载体（GST标签有增溶作用，pCOLD低温表达载体…），更换表达菌株；2.如果上述尝试还是不成功，那就只能变性纯化了，用变性剂（如6-8M尿素）溶解包含体，然后过镍柱，这样可以得到大量蛋白，纯化出的蛋白通过透析进行复性，然后测酶活。3.复性的蛋白酶活跟所用的复性缓冲液有很大关系，查文章，用他们的实验方法

1 回答3678 围观

问阳性克隆检测PCR问题

过客一名

要不用M13引物或你的引物A或D去测个序，看看究竟连接的片段是什么？

2 回答1274 围观

问请问客养的小分子量蛋白的转膜条件 OK 吗？

xuxian1225

完全可以，我做的蛋白就是11k的，100V转120分钟都没问题，90分钟对这么小的蛋白足够了。

1 回答3722 围观

问Native Page 为什么样品的下段都不见蛋白条带？

我是金博士

你的胶做得不太好啊，marker都分不开。你要是想知道条带少，是上样量少了还是降解了，可以做个上样量梯度，一般都会做个预实验，看看浓度。

1 回答2680 围观

问关于用 cre 小鼠和 loxp 小鼠获得条件敲除小鼠的问题

tntztyx

cre 采用的是calcium/calmodulin-dependent protein kinase IIalpha promoter ，启动活性就由CAMKII的启动子决定，与基因组中camkII的启动活性类似，当然有表达特异性可能有变化，毕竟是模式改变的转基因动物

1 回答9147 围观

问新手求解答

我是金博士

1：用内参照是为了评价你的各个上样孔内蛋白的总量是否基本一致，通常使用一些看家蛋白，比如β-actin、GAPDH等等。这些蛋白在所有细胞中的表达量基本一致，所以用他们来作为你加样量的对照。这样western结果中你的目的蛋白经过处理后发生变化，而内参的条带基本均匀一致。这样才有说服力，表明的确是处理因素造成目的蛋白的变化而不是加样误差或是人为造成目的条带浓度的变化。严格意义上说，内参事必须做的。

1 回答797 围观

问假如模板DNA中混有杂蛋白是不是就扩增不出来

我是金博士

你的DNA模版是怎么提取的呢？有没有进行过处理？扩增没成功，有很原因，杂蛋白的影响也要看情况，一般试剂盒都能去掉的。

1 回答1943 围观

问WB 实验中如何运用凝胶成像系统照相？加完二抗用 TBST 洗之后该做什么准备？

a5055778

洗完膜加上显色体系后，放在塑料薄膜里，轻轻推去气泡，然后直接放到照相系统里照相就可以了，系统会让你选多久曝光一次和照几张相，我一般选1min-5min/5-10张；假如你选1min一次，共照5次，那么总共就是5min，选一张最好的。复制下来再用CS analyzer之类的反色输出图片就行了。

1 回答2377 围观

问PCR产物用来跑电泳跑不出条带

我是金博士

要么胶有问题，可以同时做个参照，要么PCR不稳定，也很正常的，P不出来就要重新设计引物了哦

1 回答1858 围观

问PCR最低反应体系

我是金博士

你为啥要5μl体系呢？理论是引物和模版按比例啊，这样不太好操作呀，不符合常规呢。

1 回答2097 围观

问如何确定普通反转录 PCR 时 cDNA 的用量？

苏格兰白草莓

必须要保证cDNA的量要一致才有可比性，所以最好还是做RT-qPCR。之所以要做内参，一是利用△△C法运算得到基因差异，二就是利用内参可看得出你每孔的cDNA模板量是否具有一致性，一般来说，我们实验要求样品内参的Ct值最好相差不要超过0.2~0.5，还有值得注意的是，如果内参Ct值出现过大或者过小都会影响到你的实验数据分析，一般来说内参在Ct值=12~15的位置左右为宜

4 回答2621 围观

问为什么一定要加內参？有的样品里如尿液中蛋白分析无合适內参怎么办？

alaling

加入内参是为了消除外部操作产生的差异。比如你需要加样1ul，你能保证枪加入的就一定准确的是1ul吗？枪尖随便挂个0.1ul和不挂，差别就有10%。尿液里的蛋白如果没有合适的内参，可以考虑以添加外参的方式进行，就是在每个样品里面添加已知量的某种纯蛋白。当然，如果用纯体积或纯样品量进行参比也是可以的。最重要的是要参考文献，看看大部分人是如何处理这种问题的。

1 回答1804 围观

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