实验问答

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科研学霸天团，48小时有问必答

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问WB条带每次曝光的时候条带边缘都有黑色的一圈是什么原因？

dxy_gwrp7ndq

第一建议用5%脱脂奶粉封闭，有条件的话封闭过夜，室温下至少封闭1小时。第二你一抗二抗稀释液应该都用含脱脂奶粉的来配，这样可以降低背景。第三这种现象我也遇到过，很可能是你一抗或二抗刚刚稀释之后，没有混均匀，然后就把膜放下去了。有的时候局部浓度特别大的时候，会造成严重的非特异性结合。第四洗膜不需要洗那么长时间的。一般洗3次，每次6~7分钟就可以了。敷完二抗之后洗3次，每次10分钟，

4 回答205 围观

问如何利用血小板提取液检测血小板EP3受体

bamboopiggy

买ep3受体的抗体，直接western blot检测呗，如果少，就用elisa检测。

1 回答755 围观

问蛋白纯化有杂质怎么办？

bamboopiggy

可以在上柱前，多离心几次，去掉杂质，如果是杂带的话，就挂柱以后，多洗几次。

4 回答1676 围观

问求助：wb蛋白条带位置不对

bamboopiggy

你看一下cst说明书里，wb的条带在哪里，其实你只要跑过全膜，确定了你的位置，即使位置和预测的不一样，也是可以的，就是你的这个位置有点寸，咋感觉是你的lysis没有打开到一级结构，还是二聚体的感觉。因为40-50，70-100正好是二倍的感觉

3 回答5812 围观

问请问一下P3出现阴性一般什么情况下会出现？

bamboopiggy

你说的是阳性对照出现阴性？那别的呢？如果都是阴性，可能是抗体不好使了，或者是浓度不够。

1 回答346 围观

问P65和它的磷酸化问题

bamboopiggy

total的蛋白和磷酸化的一个趋势，这个是很常见的，你可以和内参比，只要p65磷酸化了，就是说明起作用了。

2 回答8434 围观

问请问这块胶是什么问题啊，分离胶没凝好吗？

智明在寻找春娇的路上一去不复返

看marker的话整个胶应该没问题。可能是上样量比较多用ripa稀释下看看？

5 回答396 围观

问样品中有无机杂质影响蛋白含量测定，有什么办法能降低干扰？

bamboopiggy

蛋白质的测定方法有好多，如：凯氏定氮法，双缩脲法，folin-酚法，考马斯亮蓝法，等等，你可以找一种与你的无机杂质不反应的方法来测。

4 回答728 围观

问提取鱼类肠道微生物，用来做16s测序，有哪些好的方法？

bamboopiggy

找一个靠谱的公司比什么都重要，尤其是做过鱼类16s的，否则什么样的bug都会给你弄出来。甚至会测不到。

3 回答562 围观

问western blot 内参

Y_沙琪玛

可能你用的内参是多抗而不是单抗的原因

6 回答493 围观

问小白第一次做免疫组化，该选哪种做法最稳妥啊，两步还是三步法？

dxy_gwrp7ndq

二步法是灵敏度比较高的方法，操作较三步法便捷

3 回答475 围观

问杂同一个蛋白的兔抗和鼠抗为啥结果不同？

迟C迟

首先，兔抗血清通常含有高亲合力抗体，可以比鼠抗血清识别更多种类的表位。其次，兔单克隆抗体能够以识别许多在小鼠中不产生免疫的抗原。

7 回答5166 围观

问为什么marker分子跑不到15KD？

whilt-shirt

15KD的分子建议用12%的胶，10%的胶跑不了15Kd

4 回答150 围观

问WB最后条带曝不出来以及背景颜色很黑

迟C迟

背景黑考虑1.减少蛋白的上样量2.缩短曝光时间3.如果是化学发光，请减少超敏液的使用

4 回答3098 围观

问蛋白纯化有杂带怎么办

dxy_qm66y5m7

如果是his标签的话，首先与填料结合时使用的buffer里可以加点咪唑这样可以减少特异性结合，其次洗脱的时候可以适当提高咪唑浓度，加强对杂蛋白洗脱，最后就是更换填料的类型。以上只是对his标签蛋白提纯的优化，希望有帮助。

4 回答2342 围观

问蛋白一直跑不出来，出来的位置也不太对

迟C迟

位置不对可能得原因有：1.胶浓度不对，不同浓度的胶跑出的蛋白条带的位置可能有所偏差，可以调整浓度2.抗体孵育不充分,建议增加抗体浓度，延长孵育时间3）酶失活，建议直接将酶和底物进行混合，如果不显色则说明酶失活了。选择在有效期内、有活性的酶联物4）目的蛋白存在翻译后修饰或剪切体，建议查询相关文献确定5）标本中不含靶蛋白或靶蛋白含量太低，建议设置阳性对照比对结果，增加标本上样量

3 回答762 围观

问有什么好用的软件根据氨基酸顺序构建蛋白质结构，计算蛋白质结构域，预测功能。

bamboopiggy

alphafold2和roseTTAfold两个是近期最火的。咱们国内的uni-fold，都是可以预测的。还有I-tasser，quark，swiss-model等。

2 回答940 围观

问SDS-PAGE制胶的过程中发现分离胶底部总是出现花纹，而且影响跑胶结果，是什么原因呢？

bamboopiggy

我以前也遇到过，不要把你的目的蛋白跑的太往下，在还没有变形之前就停止电泳转膜，我当时是因为电泳槽的金属丝不好了。最下面的蛋白往两边分。

3 回答968 围观

问阴性对照组没有染色，但是组织切片和阳性对照却呈弱阳性？

Y_沙琪玛

1.阴性对照在洗片过程中被污染。2.染色体浓度太高。3.染色剂清洗不彻底。

3 回答343 围观

问蛋白质浓度测量不准时，如何保证western blot上样量？

whilt-shirt

先根据BCA结果上一次，再根据第一次实验结果通过校准内参来调节上样量

4 回答669 围观

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