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问
qPCR实验中,目标基因没有起峰,其他的两个基因数据正常,可以确定是引物设计问题吗?
bamboopiggy
大概率是引物的问题,如果全部都没有起峰的话。
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问
pcr预变性的98度和96度有什么差别?以及2步法和三步法有什么区别呢
bamboopiggy
预变性的温度取决于你用的酶的要求,一定要看说明书。2步法是因为你的annealing temperature比较高,和extension temperature 接近,就可以用两步法。
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问
PCR产物为什么会拖带?
bamboopiggy
1.可能是你的胶不匀,2.可能是pcr 产物量比较大,3,可能是pcr产物降解。4.pcr特异性差,产生多种产物,有的产物分子量大
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问
qPCR处理组和对照组内参基因表达差异太大是否影响结果?
天一湖医者
qPCR处理组和对照组内参基因表达差异太大会影响结果。
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问
所在实验室pcr体系常用的有20ul,50ul,能不能100ul呢?pcr管是200ul的容积
天一湖医者
据我了解的情况来说,检测结果有可能不准确。大部分的PCR仪器现在都是一个体系的,多数为进口的塑料管。比较特殊的是罗氏2.0/1.5/1.0,ABI Step one plus(fast模式)这些体系是不一样的。如你所说,如果仪器的最大体系是200UL的话,用100UL的体系来跑是可以的.
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问
片段很大,约6kb,用了很多高保真酶都p不出来(kod, la taq等),请问还有什么好用的酶推荐吗?
天一湖医者
保真性最最强的就是Pfu Ultra 2
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问
pcr实验对样本有哪些需求呢,薄片上的组织可以做吗?
天一湖医者
样本采集后若无法马上检验需存放于4°C冷藏。需根据病情采集合适的样本。样本若需运送时一律以冷藏或包含冰块/冰袋的
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问
pcr产物电泳会有气溶胶污染吗,怎么解决呢
天一湖医者
pcr产物电泳会有气溶胶污染。PCR产物污染的形式是气溶胶污染。在空气与液体面摩 擦时就可形成气溶胶,在操作时比较剧烈地摇动反应管,开盖时、吸样时及污染进样 枪的反复吸样都可形成气溶胶而污染.据计算一个气溶胶颗粒可含48000拷贝,因而由 其造成的污染是一个值得特别重视的问题.
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问
pcr阴性对照有条带,目的基因无条带
天一湖医者
这种情况,升高退火至65度,甚至在68度做两步法PCR,或者是将循环数降低,阴性对照可能就没有扩增了。不过这样灵敏度会降低很多,应该不符合lz检测的初衷,建议更换靶基因。
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问
qPCR的结果中,三个复孔的CT值为何相差巨大
天一湖医者
加模板时是否将头伸至液面以下,保证模板加到反应液中如果上面都没有问题那就是pcr仪器的问题了,可能孔间温度差过大
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问
qPCR实验结果96孔的在多久之内加完样是对结果无大影响的?封膜封到什么程度为最好
天一湖医者
qPCR实验结果96孔的在15min之内加完样是对结果无大影响.
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问
请问需要做浓度梯度还是单一浓度呢?
bamboopiggy
可以分成正常组 造模+安慰剂组 造模+阳性对照组 造模+试验药组,只要有明显差异,没必要非要做三个组。
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1708 围观
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问
以片段为模板pcr扩增,杂带很多原因
bamboopiggy
是否可以把你的2k的片段做TA克隆,整到载体上,然后再以质粒为模板进行pcr,或者把你重叠延伸得到的2k片段,纯化后再pcr。
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2737 围观
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问
实时荧光定量qpcr
bamboopiggy
你要用内壁光滑的ep管啊,那个在逆转录过程中不会软化的,如果软化了,保证哪个地方不对了,不能用了。
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311 围观
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问
real time 实时荧光定量PCR
bamboopiggy
用可以加384孔板的电动移液的排枪,且在加样前设计好加样的位置,可以用于384孔板上样的白枪尖,每个枪尖对应孔板的一个位置。
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问
荧光定量pcr与普通pcr用的材料差不多,只是多了染料,是这样么?
汤姆卜丽波
在试剂添加上确实是这样,但是其他方面有本质上的区别,原理不同:荧光定量pcr实时监测与dna结合的荧光染料激发的荧光;普通pcr通过检测插入dna中核算染料的量来测定pcr最终产物量,一般是紫外光。反应要求:荧光定量对扩增片段有较高的要求,一般为100-300bp;普通定量可以扩增长点的片段。如果不需要检测产物分子量大小,荧光定量可以不进行电泳就对产物进行定量分析,普通pcr必须电泳。结果:荧光定
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问
逆转录形成的c DNA可以振荡离心吗?
汤姆卜丽波
可以涡旋震荡,使样品集中于管底
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问
为什么CT值与起始模板拷贝数成线性关系?
balalaLy
起始模板数越高达到阈值的需要的循环数就越低,根据两者的关系可以建立一条线性方程
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问
对照组的bar值怎么做?
bamboopiggy
1.对照组有的文章里就是1,没有bar值,2.如果你实在想要bar值,就把三个对照组的数,取平均值后,三个数和平均数比,得到三个数,这三个数,可以有bar值
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9184 围观
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问
pcr扩增时Taq酶的选择有哪些要点?
Wcrystay
特异性、耐热性、扩增速率、扩增片段长度等等
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