实验问答

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问PCR实验引物设计有什么要求？TM值一般多少最合适？

汤姆卜丽波

1、引物长度一般在15-30bp。常用的为18-27bp，因为过长会导致其延伸温度大于74℃，不适于Taq DNA聚合酶进行反应；2、引物GC含量一般为40%-60%， 45-55%为宜，GC含量过高或过低都不利于引发反应，上下游引物GC含量和Tm值要保持接近，一般Tm值不超过 5℃。3、引物所对应的模板序列的Tm值在55-80℃之间，最好为 72℃左右。4、引物的延伸是从3′端开始的，不能进行任

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问Pcr模板加的量太多会导致产物多条带，且不亮吗

bamboopiggy

按照你的酶的说明书来加pcr模板的量，加多了，会产生非特异性结合，产物条带多，且不特异。

3 回答3917 围观

问难道引物会突然不适用了吗

balalaLy

引一般引物稀释后保存在-20可以用挺久的，4度的话可能超过一个月就不敢保证了

5 回答496 围观

问rtPCR，药物、对照组设置问题

balalaLy

对，一块96孔板可以跑完。每个指标要分开，不能mix。如果你加样熟练手很稳的话，可以只做2个副孔。

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问为什么血型糖蛋白SDS-PAGE电泳时跑得慢？

bamboopiggy

糖基化会影响糖蛋白的预期大小，从而导致其再SDS-PAGE胶中的位置与分子量不一致。血型糖蛋白30000分子量，而红细胞带3蛋白分子量约 95,000～100.00，但是由于糖基化的存在，使得血型糖蛋白的电荷/摩擦系数与带3蛋白接近，所以出现在带3蛋白附近。

3 回答2349 围观

问类器官药敏实验复孔间结果数据频繁差异巨大，考虑原因为类器官大小各异复孔间细胞数差异过大，请教改善方法

天一湖医者

类器官药敏实验复孔间结果数据频繁差异巨大。立体微小组织块培养法成功率高、成本低、出结果快，但样本量极其有限，无法设置复孔求均值数据随机性误差大，无法区分混在癌组织中的正常细胞；PDX能保持人肿瘤原有的组织形态和生物学特性，准确性较高，但动物实验本身会受体内多种不可控因素的制约，接种成功率低、周期长、成本高，且无法实现高通量药筛；类器官技术成本居中，2-3周出结果，能模拟肿瘤细胞3D模式下的生存和增

4 回答627 围观

问请问为什么提取RNA的时候最后没有看到羽毛状沉淀呢？

bamboopiggy

可能你rna的浓度有点低，所以并且那个沉淀是透明的，如果太小了，你可以能看不到，没事，能用就好

6 回答1169 围观

问瑞芬太尼可以连续应用多长时间？

天一湖医者

瑞芬太尼可以连续应用不建议超过14天。

4 回答3235 围观

问地贫基因gapPCR电泳条带有粗、细，与标本浓度有关？

棋NKKP

不仅与浓度有关，与样品的质量，胶的质量，核酸染料甚至是电泳条件都有关

6 回答811 围观

问请教一下大家，医院药学实验室做血药浓度，使用的是荧光层析法，有什么实验室建设及人员资质的硬性要求么？

天一湖医者

实验室管理者应确保所有操作专门设备、从事检测和/或校准、评价结果、签署检测报告和校准证书的人员的能力。当使用在培员工时，应对其安排适当的监督。对从事特定工作的人员，应按要求根据相应的教育、培训、经验和/或可证明的技能进行资格确认。

5 回答539 围观

问PCR实验，PCR实验快速检验省去了提取试剂2的过程与正常过程检验总是结果不一致，是快速实验过程程序不对吗？

Eason老歌迷

PCR反应的关键环节有:模板核酸的制备，引物的质量与特异性，酶的质量及PCR循环条件。寻找原因应针对上述环节进行分析研究。你看看是不是省去的步骤导致的呢？

6 回答429 围观

问PCR实验过程中，不同厂家的试剂同一批标本做出的结果不一样复查也不一样是哪个环节的问题？

汤姆卜丽波

是指结果完全相反么还是有一定差异，都在保质期内的吧试剂？

5 回答421 围观

问PCR实验过程中，为什么同样的试剂会出现内标线不起，重新提取后内标起了实验结果还可靠吗？

Eason老歌迷

内标总是不出来的话，就是你操作中有个环节出问题了。阳性对照不出的原因很多，主要考虑试剂系统。内源性内标采用的是人的管家基因，存在于人的基因组中，可以监测核酸检测的全流程，包括取样，样本提取等。导致样本内标异常的原因很多，需要耐心分析，采样的质量，样本是否混匀，提取各步骤加样，八连管的匹配度，荧光收集是否正常都会影响结果。实验过程中需要足够的细心，数据分析时需要足够的耐心。检测的荧光吸收波长是不同的

4 回答1034 围观

问造成 qPCR 实验中无逆转录酶阴性对照出现假阳性的可能原因有哪些？

whilt-shirt

有可能是误加了有逆转录酶的试剂

3 回答419 围观

问最近酶切连接转化后一直没菌落，一般问题出在哪

棋NKKP

这个涉及的就比较多了，可能载体构建时设计的问题，或者筛选的条件不合适，或者培养条件不合适，或者感受态转化效率低，可以考虑设置对照去检查自己的实验体系

7 回答989 围观

问可以用于 DNA 差异筛选杂交的探针有哪些？

bamboopiggy

杂交探针是核酸分子上带有可能被检测的信号分子，如同位素或荧光标记的核酸分子。双链DNA加热变性成为单链，随后用放射性同位素（通常用磷-32）、萤光染料或者酶（如辣根过氧化物酶）标记成为探针。磷-32通常被掺入组成DNA的四种核苷酸之一的磷酸基团中，而荧光染料和酶与核酸序列以共价键相连。分为cDNA探针，基因组DNA探针，寡核苷酸探针，RNA探针。

3 回答511 围观

问有人有辅助质粒pRK2013的序列吗，网上现在查不到了。如果能提供真的非常感谢！！！

汤姆卜丽波

找有它的文章然后和通讯作者沟通，他们会很乐意给你的

3 回答147 围观

问PCR过程中提取试剂1底物添加对实验过程影响多少？

whilt-shirt

你这个不太好回答，试剂1都不知道是什么

4 回答490 围观

问用NEB的BpuEI酶1ul，切1ug的质粒失败，多加酶也不行，是酶量不够？应该用多少计量？

棋NKKP

酶切体系商业化很稳定，首先要确定自己的酶切位点是不是正确

5 回答1081 围观

问质粒构建中遇到的问题？

棋NKKP

在基因前插入要考虑移码突变的发生，而且不仅仅这一种会导致最终的不表达，还有很多原因

5 回答489 围观

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