实验问答

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科研学霸天团，48小时有问必答

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问染料法qPCR 为什么扩增曲线到达平台期后会出现下降？会影响结果吗？

whilt-shirt

有可能是模板和引物浓度太高导致的，这种情况会使基因表达偏低

3 回答1411 围观

问对于pcr引物设计和荧光定量pcr引物设计的根本区别在哪里？

dxywode

一、方法不同1、普通pcr引物设计：引物的优劣直接关系到PCR的特异性与成功与否。2、荧光定量pcr引物设计：通过荧光染料或荧光标记的特异性探针，标记跟踪PCR产物进行实时监测反应，利用与之相适应的软件对产物进行分析，计算待测样品模板的初始浓度二、原理不同1、普通pcr引物设计：为了找到一对合适的核苷酸片段，使其能有效地扩增模板DNA序列。2、荧光定量pcr引物设计：在PCR反应体系中加入荧光基团

3 回答945 围观

问qpcr和RT PCR在定量定性上面有什么区别？

Eason老歌迷

RT-PCR是PCR的一种广泛应用的变形。在RT-PCR中，一条RNA链被逆转录成为cDNA，再以此为模板通过PCR进行DNA扩增。QRT-PCR在RT-PCR体系中同时加入内参标基因的引物，使目的基因和内参基因在同一条件下同时扩增。实时PCR属于定量PCR（Q-PCR）的一种，以一定时间内DNA的增幅量为基础进行DNA的定量分析。他俩相结合，能用微量的RNA来找出特定时间细胞组织内的特别表达的遗

7 回答5212 围观

问做qPCR曲线出现异常？

whilt-shirt

有可能是模板浓度太高了，在基线期内就起峰了，仪器会默认起峰的线条仍为基线部分，将扩增曲线往基线位置下拉，因此你的曲线就趴下来了。这种情况大家也不要慌，可以减小基线终点（例如基线期默认 3 - 15 个循环，改为 3 - 10 个循环），重新分析数据，一般都能得到一个比较好的结果。

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问DNA扩增的时候，PCR条带拖尾？

dxywode

拖尾在生物专业词汇叫做smear。造成此的原因有多种。一般来讲，有以下几点：1，引物设计不佳，造成了拖尾现象。2，PCR中DNA浓度加的太多，造成了拖尾。3，mg2+浓度加的太高，造成了拖尾。4，跑胶电压不合适，造成了拖尾。5，退火温度不合适，造成了拖尾。这些都可能造成拖尾，请认真分析之。谢谢。

5 回答5542 围观

问q-pcr验证高通量测序结果，结果为啥反复横跳？

汤姆卜丽波

这样的结果是不行的，三次独立重复的话。每次都要提RNA之后测浓度，必要时还要跑胶防止降解

6 回答493 围观

问EP凝胶的聚合缓冲液是什么？

dxywode

琼脂糖凝胶电泳缓冲液常用的缓冲液有TAE和TBE，而TBE比TAE有着更好的缓冲能力。

2 回答566 围观

问悬浮细胞做转染，lip3000，6孔板每孔种多少细胞转染效率比较高，现在种15万个细胞每孔，感觉转染效率不高

dxywode

如遇转染效果不佳，可采取优化方案对实验进行优化：1. 优化转染条件包括：转染试剂的用量、DNA密度、细胞密度、试剂和DNA混合孵育时间等等。2. 同时细胞污染也是造成细胞死亡，转染效率低下的一大原因。转染细胞用的质粒必须保证无菌。分享一个小秘诀：将提完质粒后或者提的最后一步，用75％乙醇沉淀，这样就除菌了。3. 转染用的质粒首先要保证数量，一般为2μg以上。如果质粒纯度不够或者含有细菌LPS或其他

3 回答1258 围观

问如何建立稳定铂耐药的卵巢癌细胞？是否需要先检测敏感细胞的IC50？检测IC50的规范操作是什么？

balalaLy

先检测IC50，再用比IC50高的大剂量冲击，接着用IC50的剂量维持一段时间，再重新测IC50

3 回答432 围观

问关于gDNA基因组DNA

汤姆卜丽波

一般pcr.扩增模板浓度几ng到100ng都可以，普通的酶就可以扩出来，应该不是浓度的问题，跑之前确定一下模板没有降解，然后引物特异性和有效率

5 回答1497 围观

问imageJ处理WB条带时，为什么要去背景？去背景的原理是什么？

balalaLy

imageJ读取的是所选区域的灰度值，如果不去背景，会干扰读取值，结果偏差会很大

3 回答1738 围观

问染色体做完镜下看是实心的，像一个细的木棍

dxywode

只能是大概说一下，因为缺少图，其实你多看一些片子就会发现，做核型分析的时候，视野中出现的结构应该有分离良好的染色体，边缘很粗糙的圆形，边缘光滑的圆形大致三种类型。边缘粗糙的那种就是染色质在形成染色体的过程中。丝状的染色质盘绕在一起，是很难分开的，表现出来就是一个圆形的细胞核的样子。

2 回答466 围观

问牛卵母细胞wb一抗好难找呀，买了几个都做不出条带什么原因求大神指导！

汤姆卜丽波

可以看一看相关的文章，看看文章里的抗体是在哪里买的，问通讯也可以

3 回答366 围观

问加尾法逆转录miRNA的qPCR如何区分前体和成熟体？

汤姆卜丽波

前体和成熟体的大小序列都不一样。除非你特别设计不同引物，不会一起扩增

4 回答463 围观

问反转录同样按试剂盒建议量加，之后由SYBR染料法改为taqman探针法，结果曲线非常乱，不具有特异性，怎么改进

bamboopiggy

跟反转录和sybr的关系不大，可能是你taqman探针法的引物有问题

4 回答473 围观

问qPCR实验平行的孔总是重复性很差，该怎么改进呢？加样时有推荐的先后顺序吗？

balalaLy

每个孔加的量很低，要留意一下有没有把样品都完全打出去了，枪头上有没有残留

4 回答130 围观

问半定量PCR和定量PCR在斑马鱼这类模式生物上的类似实验自己可完成吗？还是需要专业设备

汤姆卜丽波

就和其他生物一样操作就可以了，组织取核酸，不需要专业设备

4 回答230 围观

问跑荧光定量pcr 曲线有双峰,primer设计引物分数是满分，求大神给个建议。

balalaLy

如果是主峰前面出峰，一般是引物二聚体，如果是后面，可能是非特异扩增，可降低引物浓度，退火温度和镁离子浓度

6 回答470 围观

问做了一次，因为我的细胞增殖速度很慢，培养24h基本没有增殖。所以我铺板的细胞密度挺大的，每孔undefined10五次。铺板后第二天换低血清培

balalaLy

你的药物会干扰cck8的结果，加cck8之前最好还是要洗一下。如果药物促凋亡效果明显的话可以不做饥饿处理。

3 回答604 围观

问PD-1的流式抗体要怎么选择？

balalaLy

一种抗原就对应一种抗体（各种剪切体、修饰后的另说）

3 回答964 围观

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