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问
做qpcr,样本较多,96孔板一次性跑不完所有样品如何解决?
balalaLy
分批做,每次每组选3个样,这样你就有三次生物学重复了,多好
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问
组织DNA提取用到哪些试剂,其主要作用是什么?
balalaLy
比如蛋白酶k,消化组织或细胞的蛋白,加快释放DNA分子
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问
细菌做定量pcr,以cDNA做模板,pcr条带很杂,而用基因组做模板条带单一,这是什么原因?谢谢回答!
bamboopiggy
cdna是不同长度的,如果你的引物不是那么特异,产物就会很多。而genomic dna做模板,引物是跨内含子设计,比较长,非特异产物在30秒内扩增不出来
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问
请问细胞培养基配制中添加的血清,如急需使用进行培养基的配制,可以不进行梯度解冻直接37℃融化使用吗?
汤姆卜丽波
-80的血清至少需要24小时-20,才能避免蛋白凝集
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问
PCR混检电泳阴性正常无条带,但单检电泳阴性出现和阳性相同位置的条带,向高手请教?
汤姆卜丽波
混检的时候模板量混在一起每个都不高,通过扩增,假阴性结果很容易出现的。
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问
请问左旋多聚赖氨酸包被96孔板,每孔加多少工作液合适啊
汤姆卜丽波
我们一般包被液每孔加200ul。
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问
请问半荧光定量引物怎么设计?片段大小设计多少合适?
天一湖医者
荧光定量一般限定在100-250bp间,半定量似乎没有太严格的限制,可以放宽到500-600bp吧
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问
请问在进行荧光定量时,一般qpcr片段应设计多大,一般情况下是80-180bp左右大小,但看其他文献有的设计片段大小240bp?
天一湖医者
荧光PCR主要包括两种形式一种是sybr green I技术,对片段长度没有特殊要求,一般100-400都可以,当然扩增片段越大,溶解曲线温度越高,有利于区别引物二聚体形成的溶解曲线,SYBR GREEN的特异性主要看引物;
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问
做某个细菌绝对定量需要找到这个细菌引物,然后通过模板DNA扩增成目的片段,然后再将目的片段导入到质粒中,再稀释成标准品。是这样吗
秋秋欣欣
是这样的,做细菌的定量,需要先找到目的片段的引物然后扩增
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问
大体系PEI转染293S细胞,细胞1.undefined10^6/ml,质粒与PEI比例为1:4,第二天细胞过滤下降,是什么原因呢?有做过的吗
bamboopiggy
293S细胞是被驯化成能够悬浮培养且能够耐受低钙离子培养条件的293细胞系。你可以靠过梯度做质粒与pei的浓度比例:从1:2到1:8
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问
重组质粒,阳性克隆跑出来有目的条带(图1),提质粒双酶切后只有一条带,而且和原始质粒条带所在位置差不多。
bamboopiggy
1.同时做个单酶切看看,条带位置是否高一些,2,用载体的引物做pcr,排除假阳性
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问
为什么必须将DNA切碎至少1000bp大小(大约3个核小体~400-500bp)?
天一湖医者
为确保ChIP实验有良好精度。若您的平均片段长度大于1000bp,您将会分离获得包含您目标序列的DNA,但所要研究的蛋白会离您目标序列有700个核苷酸的距离。
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问
半悬浮的杂交瘤细胞液氮罐内冻了一年后复苏起来,养两代以后细胞不贴壁了正常吗?应该怎么处理呢?
bamboopiggy
考虑一下第一株细胞是不是污染了
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问
链霉菌能否直接以基因组作为模板进行荧光定量PCR?
bamboopiggy
这个取决于你的实验目的,看你是要检测什么。是mRNA还是genomic DNA
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问
IP后实验组有和IgG相同的条带,但阴性对照没有
月下扣动板机
看不到B蛋白的Western条带 或者 条带较弱。 (因为IgG并不能特异性的与任何蛋白结合,那么IgG所带下来的蛋白都是非特异性的与IgG结合的蛋白,得到的东西就是背景。)
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问
弧菌接合转移
bamboopiggy
你的双抗没有用错吧?氨苄青 霉素(Amp 100 μg/mL)、氯霉素(Cm 25 μg/mL)?如果前面操作都没有问题,考虑一下板子的抗性问题
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问
表型与表观遗传学
秋秋欣欣
表观遗传学属于表型的一种,可以纳入的
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问
[求助]细胞焦亡WB检测焦亡相关蛋白
汤姆卜丽波
如果条件允许,推荐都做一下我们是两种都做的,确保蛋白能检测出来
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问
为什么提的小鼠肠道固有层细胞以IFN-γ、IL-4、IL-17A为标记物的Th1、Th2、Th17细胞流式特别少(刺激阻断过)?
秋秋欣欣
Th1的表面分子:CD4+CXCR3+,分泌IFN-γTH2的表面分子:CD4+CCR4+CCR6–, 分泌IL-4, IL-5, IL-13。选用细胞因子来分型不如用表面分子好。因为是胞质内,需要固定和通透细胞膜,导致细胞损失。细胞流式也会相应减少。
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问
做ChIP试验,必须做甲醛固定么?
dxyjonas
不一定,有几种其他固定剂在某些实验中效果很好,但甲醛是最常用的,因为它可以将距离较近的DNA和蛋白共价连接在一起。当然,对于一些距离较远的分子,可以使用其他固定剂,如DSG。在设计ChIP实验时,这些都是需要考虑的因素,但在大多数情况下,甲醛是固定样本的良好选择
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