实验问答

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科研学霸天团，48小时有问必答

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问蛋白大小为40k左右，应该选择什么标签

天一湖医者

蛋白纯化首选His-Tag，Western blot首选Flag-Tag，免疫共沉淀可选择Flag-Tag或其他常用标签如HA、cMyc，活细胞成像则应该选择荧光蛋白等。

1 回答273 围观

问细胞加药处理，需要给细胞饥饿处理吗？

bamboopiggy

细胞加药，不需要进行饥饿处理，除非你的药物和血清会发生反应。

3 回答4063 围观

问免疫细胞和肿瘤细胞共培养时，基本注意事项有哪些呢

申东熙老伯

要看你的共培养是直接共培养还是间接共培养，免疫细胞和肿瘤细胞一般是间接共培养，用小室将两种细胞分离开，让细胞因子传递。

2 回答848 围观

问为什么石蜡切片在染色过程中会出现脱片的现象

申东熙老伯

染色工程中出现脱片可能是之前做的过程有问题，用盐酸的时候记得不要在盐酸里等太久，不然会脱片。

3 回答625 围观

问PCR实验结果发现目的蛋白无CT值是什么原因

天一湖医者

原因:反应循环数不够一般都要在35个循环以上，可根据实验情况增加循环（如至45循环），但高于45个循环会增加过多的背景信号检测荧光信号的步骤有误一般SG法采用72℃延伸时采集，Taqman法则一般在退火结束时或延伸结束采集信号引物或探针降解可通过PAGE电泳检测其完整性模板量不足对未知浓度的样品应从系列稀释样本的zui高浓度做起模板降解避免样品制备中杂质的

3 回答1078 围观

问在体和离体记录信号的frequency和amplitude分别代表什么意义？

天一湖医者

频率(Frequency)，振幅(Amplitude)，

1 回答364 围观

问免疫组化和WB可以用同一种抗体吗？

天一湖医者

可以，如果所用的抗体识别的是蛋白上连续的几个氨基酸，也就是线性表位，那么这种抗体可同时用于免疫组化和WB，而如果抗体识别构象形表位，则只能用于免疫组化。

5 回答2598 围观

问我做的蛋白质分子量很小（10KD），请问怎么做WB？

天一湖医者

1）可选择孔径0.22um的PVDF膜或者NC膜，转膜时间缩短，另外可采用Tricine-SDS-PAGE体系； 2）也可以选择PSQ 膜，同时缩短转移时间。也可以将两张膜叠在一起，再转移。其他按步骤即可。

4 回答1288 围观

问提取蛋白后浓度显示基本正常，但是转膜后丽春红染色看不到蛋白的位置，有marker，这是怎么回事呢？

天一湖医者

可能是转膜没转过去，或者转过了。你电转缓冲体系有问题，可以试着加点SDS，会好一点。

3 回答428 围观

问在封闭之前膜需要漂洗吗？是用什么漂洗呀？

天一湖医者

不用洗的，封闭前后都不要洗，封闭后的更没有必要洗，因为我们的抗体就是用封闭液来配的。效果都很好！

4 回答265 围观

问吉林中医药杂志投稿

天一湖医者

没有退稿，现在投稿审核都比较慢，慢慢等吧，

1 回答272 围观

问求教：lnc RNA干预载体的构建？

天一湖医者

1. 选择合适的载体，依据实验室现有的条件进行选择：plvx-puro，Amp，puro，其他慢病毒载体的原理相似，例如pLenti-puro等 2. 找到基因的CDS区，复制；对于LncRNA，则直接选择全部序列即可 3. 用primer5找到目的基因上没有and载体有的酶切位点 4. 确定酶切效率，在酶边是否需要加保护碱基以提高效率 5. Kozak序列（针对表达蛋白的载体，而对于L过表达载

1 回答209 围观

问MCAO模型为什么总是进不到满意的深度

天一湖医者

插线栓主要还是要有耐心，插颈外的时候要牵扯颈外。不过只要你从颈外进到颈总，然后把牵扯颈外的线换个方向，线栓就会进到颈内了。

1 回答759 围观

问动物肝癌细胞H22稳转

bamboopiggy

是不是你的基因的问题，过表达会增加血管的通透性，而敲低，会降低血管通透性。

1 回答403 围观

问粪菌移植测定菌量

balalaLy

文献中比较普遍的方法是涂培养板到第二天计算菌落数量

1 回答349 围观

问共聚焦免疫荧光分析

balalaLy

一种是可以取多个视野计算荧光强度然后取平均值，一种方法是计算阳性染色的细胞数

1 回答1244 围观

问Western blot实验时背景高且不均匀怎么办？

天一湖医者

封闭物用量不足，提高封闭浓度，使用适当体积保证孵育时完全覆盖。转印膜封闭物使用不当，检测生物素标记的蛋白时，不可用脱脂奶封闭。封闭的时间不够，延长封闭时间，抗体非特异性结合减少，抗体的浓度和孵育时间抗体浓度过高或洗涤不彻底，降低抗体浓度，增加洗涤时间和次数化学显色底物过多减少显色底物用量

3 回答282 围观

问在表面活性剂裂解及酶解法进行生物样品预处理实验中，为避免细胞内蛋白质或核酸水解酶释放到溶液中降解生物大分子，需要注意什么？

天一湖医者

为避免细胞内蛋白质或核酸水解酶释放到溶液中降解生物大分子，可以加入蛋白水解酶抑制剂。

1 回答226 围观

问WB实验跑出来的目标条带信号很弱是怎么回事

青柠清心

提取蛋白质过程中，应在低温环境下进行，以抑制蛋白酶的水解作用（可加入适合的蛋白酶转移不完全或过转移，可以用丽春红染膜并结合染胶(考马斯亮蓝)后确定条带是否转至膜上或转移过头；适当调整转膜的时间和电流抑制剂）。一抗孵育时间不足，建议4℃结合过夜，或者是由于二抗与一抗不匹配，选择针对一抗来源的种属的抗体。洗膜过度，洗膜时间不宜过长，加入的去垢剂不宜过强或过多，建议使用0.1%的弱去垢剂Tween-2

6 回答417 围观

问玻片测试时容易起雾，有好的方法吗？

天一湖医者

把盖玻片泡进酸性液体中，或者可以将盖玻片按压在平面木头上来回摩擦。于是雾便轻易地被木头磨掉了。而且不用担心盖玻片是不是会被刮花，因为玻璃的硬度大于木头。

1 回答443 围观

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