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问
移植鼠瘤免疫组化可以用鼠抗人抗体吗
Eason老歌迷
我也做裸鼠移植瘤的,我老师说虽然是长在裸鼠身上,但它长的瘤子还是人的细胞长的,所以应该用人的抗体,因为细胞的基因型是人的基因型。
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问
单克隆抗体和多克隆抗体怎么选?
天一湖医者
1,如果该蛋白在胞质或胞核中表达有多种存在形式,比如磷酸化和非磷酸化,而你需要检测的是其中磷酸化蛋白的,那么就要用单克隆的磷酸化抗体,如果你只是检测这种蛋白,是否存在,就可以用该蛋白的多克隆抗体。2,就是用了磷酸化蛋白的单克隆抗体,多克隆抗体也是必不可少的,因为你同样要使用多克隆抗体,跑个多克隆抗体的条带做对照,这样更能说明磷酸化抗体的表达和活化的情况,我认为这是必须的。并且我已经做的protc
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问
诱导蛋白诱导不出来是什么原因,有什么可以诱导出来的方法吗?
天一湖医者
一是诱导条件不适合目的蛋白的表达,可通过改变培养基,温度,诱导剂等条件重新摸索出合适的诱导条件。二是目的蛋白的菌种有问题,可通过涂板挑选单克隆菌落重新培养,或者质粒重新转化表达菌株等方法优化菌种。
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问
IMage pro plus无法显示计算面积
Eason老歌迷
去measure里面,找到count/size。里面“select color”选着颜色,即需要统计颜色的面积,可以直接使用corlor cube based 里面的吸管工具。例如这里统计白色的部分。记得选中预览模式,就可以看到选中的区域了。也就是图中红色部分会被统计,close回答上一个界面,进行计算,点击“count”。count之后没啥反应啊,是的,表面上看起来如此。其实是要去调出结果。过v
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问
厚壁菌门与拟杆菌门
Eason老歌迷
就正常培养就行了,它两属于厌氧菌,
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问
免疫荧光和HE染色的冰冻切片
Eason老歌迷
不行,不可以,少了一个步骤,你得固定
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问
多巴染色的多巴孵育可以后续对切片进行孵育吗?相较于最开始使用孵育有什么大的差别吗?
Eason老歌迷
可以后续对切片进行孵育。相较于最开始使用孵育没有太大差别。
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问
目标蛋白大小在15-20KDa,半干法转膜55min,转完膜的胶用考马斯亮蓝染色发现蛋白还在胶上,但是marker已经转到膜上了
inventbiotech
转膜液很关键,转膜液这么小的蛋白SDS还是要控制量,转膜液选好了之后,转膜时间,选一个彩色maker做标志,但是maker过去了蛋白不一定过去,但是marker没过去,蛋白一定没过去
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问
细菌定量荧光标记实验,加入钙黄绿素后直接发荧光,而不是等到细菌生长之后再发荧光来较快的提示细菌有没有生长,怎么调整实验?
Miracle星
检查一下,是不是步骤有不对的地方?钙黄绿素染色步骤1、用DMSO制备1 mM 的钙黄绿素溶液,并用PBS将其稀释制成1~50 μM的钙黄绿素溶液。2、将1/10细胞培养基体积的钙黄绿素溶液加入到细胞培养基中。3、在37℃培养细胞15-30分钟。4、用PBS或适当的缓冲液洗涤细胞两次。5、用490 nm激发波长,515 nm发射波长的滤光片的荧光显微镜观察细胞。a、如果钙黄绿素溶液很难进入细胞,可以
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问
为什么用His的抗体 杂出了GST的条带?
小镇少年在学习
可以考虑换个his的抗体,his抗体也是识别HHHHHH,如果你目的蛋白里面有两三个连续的,然后抗体特异性又不好,也是可以识别的。
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问
原核表达了目的蛋白融合蛋白88.3kDa,样品同时跑了两块SDS-PAGE一个做了考马斯亮蓝一个做了WB,但是WB条带很怪异
小镇少年在学习
第一建议Wb再重新做一下,弄个清晰的条带,方便确定蛋白是否表达。其次80多kd蛋白已经有点稍微大了,如果不表达,建议考虑真核系统
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问
race实验中特异性引物如何设计?有没有什么判断标准?
Miracle星
引物设计 使用锁定引物(lock docking primer):在oligo(dT)引物的3′端引入两个简并的核苷酸MN(结构为5′-oligo(dT)16-30MN-3′,M=A/G/C;N=A/T/C/G)。使用锁定引物可使引物定位在poly(A)起始位点,消除了在合成第一条cDNA链时oligo(dT)与poly(A)尾的任何部位结合所带来的影响。3′RACE以3′末端的poly(A)序列
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问
分离胶中忘记加没加SDS会不会有什么影响?浓缩的加了
inventbiotech
,理论上是应该跑不动蛋白在里面,不要冒险,重新配一块比较好,做一次不容易,忘记了就重来吧,建议配置时,加一样在实验记录本上划一样,就记不错了,好记性不如烂笔头。
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问
分子量小于10KD,western blot一直跑不出来,而且膜很扭曲
inventbiotech
分子量小的蛋白WB不好跑,一个是因为蛋白提取时容易提取不到,发生丢失。再加之跑电泳,转膜这些过程他也很容易丢失,太小了,电泳跑得快,转膜也跑得快,但是这一切都得是在提取蛋白时,提取到了这些小蛋白,建议使用不容易发生蛋白丢失的柱式法总蛋白提取技术进行蛋白的提取
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问
样品较小如何提高蛋白得率。
whilt-shirt
可以选择高通量组织研磨仪,提取率高且快速
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问
如何检测高丰度蛋白中的低丰度蛋白
李金喜
LC/MSn分析为鉴定复杂混合物中的蛋白质提供了强有力的手段。安捷伦的蛋白质组学解决方案(内流蛋白组学解决方案(Nanoflow Proteomics Solution))将先进的纳流HPLC和离子阱MSn完美地结合以来,开创了分离和鉴定低浓度蛋白质的快速解决方案。
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问
WB计算出蛋白样品浓度后操作原理是什么?
inventbiotech
需要等蛋白量等体积上样,这样可以让跑出来的条带均一美观,后期蛋白量比较也更容易
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问
收细胞样本时候看着很多,每组加30微升裂解液裂解细胞提蛋白后BCA定量蛋白浓度低,原因?
inventbiotech
如果是在板子里直接进行细胞裂解蛋白提取,样品很多是,裂解液粘稠糊在板子上会影响蛋白得率,板子上直接操作,还会存在因裂解液不强导致的细胞未被裂解,致使蛋白浓度过低。
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问
目的条带时而清晰,时而不存在怎么办?一样的实验条件
inventbiotech
一时可以检测到一时检测不到,可能是样品在进行蛋白抽提时有蛋白丢失导致的,尤其是目标蛋白定位于细胞膜细胞器细胞核等位置上的蛋白,容易发生丢失。当然还有有可能是转膜失败,WB检测过程可以设置质控点,丽春红染色检查转膜是否成功。一步步分析看看原因出在哪里,如果是不是WB检测的问题,那就是蛋白提取的问题,如果是的话,建议使用柱式法总蛋白进行蛋白提取,可以解决这个蛋白丢失问题
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问
WB内参还不错目的蛋白跑不出
bamboopiggy
首先要确定你的抗体好使,有阳参么?或者你可以试试孵育一个全膜,看看你的目的条带具体出在什么地方。
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