乳腺癌细胞支原体怎么pcr检测呀？求详细试验方法

为了准确判断细胞是否有支原体的污染，待测的细胞培养液样品需要取自换液后培养2-3天且汇合度在90%左右的细胞培养液上清（贴壁细胞）。悬浮培养的细胞也需要在换液传代后，让细胞生长2-3天再取培养液进行检测

实验步骤：

收集样本：从培养的乳腺癌细胞中提取DNA，同时准备一份支原体阳性对照样品和一份无模板对照样品。

设计引物：使用支原体特异性引物，可以设计一对PCR引物，用于扩增支原体16S rRNA基因。可以使用已发表的文献或公共数据库（如NCBI）中的序列信息来设计引物。

PCR扩增：设置PCR反应体系，包括PCR引物、模板DNA、反应缓冲液和聚合酶等。进行PCR扩增，通常可以使用以下程序：95℃预变性2min，95℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸1min，循环30-40次，最后72℃延伸5min。反应结束后可以进行凝胶电泳，观察PCR产物。

检测PCR产物：使用凝胶电泳检测PCR产物，支原体16S rRNA基因的PCR产物约为1500bp。如果样品中存在支原体DNA，则应该能够在PCR产物中检测到相应的条带。如果没有条带，说明该样品中不存在支原体DNA。

阳性对照：如果对照样品的PCR结果为阳性，则说明PCR反应体系有效，但并不能说明样品中存在支原体。因此，需要使用支原体阳性对照样品进行验证。

负性对照：如果无模板对照样品的PCR结果为阴性，则说明PCR反应体系没有受到污染。如果无模板对照样品出现条带，则说明PCR反应体系受到污染，需要重新进行实验。