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        细胞支原体污染的PCR检测

        互联网

        7035

        支原体菌株来源:

        M.Arginini ATCC23838 精氨酸支原体

        M.FermentaneATCC19989发酵支原体

        M.SalivariumATCC23064唾液支原体

        M.HominisATCC23114人型支原体

        M.OraleATCC23714口腔支原体

        M.HyorhinisATCC29052猪鼻支原体

        其共同引物序列来自16s和23s保守区域,外部引物为F1 5′-ACACCATGGGAGCTGGTAAT-3′,R1 5′-GTTCATCGACTTTCAGACCCAAGGCAT-3′;内部引物为 F2 5′-GTTCTTTGAAAACTGAAT-3′,R2 5′-GCATCCACCAAAAACTCT-3′。

        PCR反应体系和条件:10×缓冲液(10mMTris-HCl、500mMKCl、20mMMgCl 2 、0.01%明胶)、PrimerF1、R1、F2、R2的浓度为2nmol/μL、2.5mMdNTPs、Taq酶、H2O、石蜡油覆盖。反应温度和时间为:94℃/2min预变性、94℃/30s变性、55℃/1min退火、72℃/1min延伸,循环30次后72℃延伸5min。第1次PCR反应取模板10μL,第2次PCR反应以第1次PCR扩增产物为模板取1μL。

        下面是更详细的:

        污染测试——支原体:PCR方法

        原理: 利用具特殊专一性之primers,经由PCR反应来复制mycoplasma DNA。所用之primers来自mycoplasma之conserved 16S-23S rRNA序列,由于此段spacer之序列依mycoplsma种类不同而不同,因此可依所复制之DNA大小及其restriction fragment大小差异来作侦测与鉴定。

        特点:灵敏(e.g. 0.1~1.6 CFU / 5 ul sample) 与快速(一天)。可侦测不易培养之mycoplasma (e.g. M. hyorhinis)。不需培养mycoplasma作为正反应对照组,避免可能之污染。

        缺点:PCR反应很灵敏,易有伪阳性结果。此方法尚在评估中,故结果仅作为参考和内部品管之一部份。

        材料与设备:

        ATCC mycoplasma detection kit:可作50~100 reactions.

        提供1st stage primer mixture与2nd stage primer mixture

        positive control DNA (A. laidlawii ; M. pirum)

        PCR reagents :

        Taq polymerase ( 5 U / ul )

        dNTP( dGTP, dCTP, dTTP, dATP, 1.25 mM each )

        10x PCR buffer (with 1.5mM MgCl2)

        25mM MgCl2

        sterile ddH2O

        Machine / Equipment:

        PCR thermal cycler

        agarose电泳设备

        DNA电泳胶体观察设备

        无菌PCR反应管

        无菌1.5 ml微量离心管

        无菌2ul, 20ul, 200ul, 1000ul Tips/ Pipetmans

        方法: 此PCR反应是一种nested PCR,包括2阶段PCR反应,1st stage PCR结束后,取其反应物作2nd stage PCR,然后取2nd PCR产物作agarose gel electrophoresis,依DNA band之有无及片段大小来分析结果。
        结果:使用UV light观察,并照相记录。

        不过应用较多还是巢式PCR

        方法:此PCR反应是一种nested PCR,包括2阶段PCR反应,1st stage PCR结束后,取其反应物作2nd stage PCR,然后取2nd PCR产物作agarose gel electrophoresis,依DNA band之有无及片段大小来分析结果。

        结果:使用UV light观察,并照相记录。

        方法再详尽点:st stage PCR reaction(total volume 25 ul):

        测试样品 ( 2 ul / each )

        直接取样测试细胞之培养液。

        Positive control : mycoplasma DNA ( A. laidlawii ; M. pirum )

        Negative control : ddH2O

        Reaction mixture ( 23 ul / each )

        10x PCR buffer (含1.5 mM MgCl2 ) 2.5 ul

        1st stage primer mixture 0.5 ul

        dNTP ( 1.25 mM each ) 1.0 l

        MgCl2 ( 25 mM ) 0.5 ul

        Taq DNA polymerase ( 5 U/ul ) 0.1 ul

        ddH2O 18.4 ul

        PCR program ( 1st PCR与2 nd PCR相同):使用PCR thermal cycler

        step 1 : denaturation: 94 ℃ 30 sec

        step 2 : denaturation: 94 ℃ 30 sec

        step 3 : annealing: 55 ℃ 2 min

        step 4 : extension: 72 ℃ 2 min

        重复3.1.3.2至3.1.3.4步骤30 cycles

        step 5 : final extension 72 ℃ 5 min

        2 nd stage PCR reaction(total volume 25 ul)

        测试样品:1st stage PCR product(1 ul / each)。

        Reaction mixture ( 24 ul / each )

        10x PCR buffer (含1.5 mM MgCl2 ) 2.5 ul

        nd stage primer mixture 0.5 ul

        dNTP ( 1.25 mM each ) 1.0 ul

        MgCl2 ( 25 mM ) 0.5 ul

        Taq DNA polymerase ( 5U/ul ) 0.1 ul

        ddH2O 19.4 ul

        PCR program同3.1.3;使用PCR thermal cycler

        胶片电泳分析

        胶片 (2.0%) 置备: 将2 g agarose溶于100 ml ( 1x ) TAE buffer。

        电泳液:(1x) TAE buffer(Tris-acetate/EDTA electropheresis buffer)

        选择100~500 bp DNA size Marker:取100 bp ladder Marker 5 ul ( 25 ng/ul )

        取10 ul 2 nd stage PCR产物分析,各加入2 ul ( 6x ) loading dye。

        进行电泳分离100V, 25 min。

        胶片染色:ethidium bromide染色10 min,H2O退染10mim。(EtBr为致癌物质,请戴手套并小心操作)

        结果:使用UV light观察,并照相记录。

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