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科研学霸天团，48小时有问必答

问细胞免疫荧光探讨

旅途中的搬运工

我最近也在做，做了好几次甩片了，准备试试在流式管或者EP管里面固定加染色了，做完最后一步再甩片了。甩片完了在固定，细胞形态会改变，结构可能也完整

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问外周血单个核细胞（PBMC）

丁香实验

破骨细胞没诱导培养过，刚看了下资料，猜测你估计是用血液单核细胞诱导法诱导分化培养，这个就需要贴壁的单核细胞，单核细胞是半贴壁的细胞，可以只加培养液不加血清诱导因子于培养箱孵育1-2h，然后用PBS慢慢清洗去除不贴壁的淋巴细胞和其他杂细胞杂质等，这样六孔板下单核细胞纯度就高了，看了你这图片，铺板密度有点低啊，以前做过2-undefined10^6/ml铺孔PBMC分离单个核细胞，然后洗涤纯化，单核纯度很高。然后加

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问大家来谈谈95D,95C的培养心得吧

丁香实验

谢谢评论，今天36h，细胞在10cm皿和六孔板里全死了。我估计消化确实有问题，但是不知道到底是消化过度还是消化不足。同时养的A549、293T贴壁也不好。12h了，贴壁后形态还是圆的，贴壁不稳当

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问CCK8实验求助…

丁香实验

历经三个月，终于测出了满意的结果，细胞量一定不能多，我最后用的5000/孔，其次，染毒加血清很重要，之前一直用的无血清培养基配药，所以实验组有时会高于对照组

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问最近细胞总是复苏失败，是什么原因？

shijunwen2007

细胞冻存和复苏的原则是慢冻快融，只要按着这个标准去做，一般细胞都不会受太大的损伤。你说细胞细胞在冻存后复苏一开始成活率还好，最近复苏不成功，考虑是冻存后保存的原因，是-80度还是液氮保？-80度保存是否由于经常开启导致温度经常波动？温度的经常性波动致使冻存细胞受到损伤，所以复苏不成功。

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问肺癌 A549 为什么细胞不贴壁了？

SHINING579

除了以上说的，还可能是培养瓶的问题，以前找别人买贴壁细胞培养瓶，结果她给我送成了用于悬浮细胞培养的培养瓶，细胞也是不贴壁，所以，建议你核实一下是不是这个原因

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问培养箱出问题，细胞还能用吗？

达达力呀

你是做什么检测的？我们之前遇到过断电的情况，我们是做细胞核型分析的，结果还好。

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问细胞复苏时如何换液呢？

elite_xy

冻存细胞取出后37℃速溶，取15ml离心管，加入10ml含血清培养基，将冻存管中液体（通常1.5ml）也加入离心管中，习惯轻吹几下混匀，1200转常温离心5min，去掉上清，加入5ml含血清培养基，轻吹制成细胞悬液，加入到培养瓶中，即可。注意，新复苏的细胞不要经常去看去动。换液的话，只要把培养基吸出，再加入新的培养基就可以了。如果你复苏的细胞长得很不均匀，可以胰酶消化下来再混匀后在重新加进去（像正

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问用 -70℃ 冰箱细胞冻存复苏成活率低的原因有哪些？

chinalip

1、细胞冻存于－70-80℃保存半年左右是没有问题的，关键是用于冻存的细胞首先状态要好，然后进行程序性降温，4度1h，-20度2h，后转移到-80度。当然也可以使用程序降温盒（提前拿出来解冻）。2、DMSO的浓度10%左右为最好。3、复苏和冻存的程序怎样才能达到最好效果？复苏和冻存的总的原则是慢冻速溶，复苏时预先打开水浴锅37度，将冻存细胞取出立即溶解，加入培养基后离心五分钟，重悬细胞后置于细胞培

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问PBS 容易把细胞冲散，细胞刚过夜是因为贴壁不牢吗？应该怎么改进？

五里云

划痕要用贴壁牢一点的细胞，一般只能用于上皮，纤维样细胞系。

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问胚胎细胞凋亡检测用哪种试剂盒比较好？

lijuan2008_李娟

Annexin V-FITC细胞凋亡检测试剂盒，不错，实验室都在用

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问细胞免疫荧光

浩ert

注意一抗浓度

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问细胞未出凋亡，可能的原因是什么？

alaling

如果你确定这个药物对正常人的窗口上限是200微摩尔，那么这个细胞系很可能就是对你的药物是耐药的。究其原因有两个，一个是其天生耐药，另外一个，也是最大的可能就是这个细胞株是经过低浓度药物培养起来的耐药株。所以传代越多不太会产生耐药性，但如果你这本身是低浓度药物培养起来的耐药株，就会出现耐药的情况。由于很多细胞系经过无数传代，其中又经过无数处理，记录不清的情况非常常见，所以细胞很容易出现类似的耐药

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问肝细胞 HL-7702 要怎么培养？

amyliu33

如果回输给人类，要用无血清的培养基。肝细胞为多边形，贴壁培养。

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问关于 PHA 刺激 PBMC 增殖，用 CCK-8 检测，实验孔 OD 值却不稳定是为什么？

roby_0_0_2000

你的PHA-p 5ug/ml就可以了，浓度大了自然会死。死于过度刺激。还要加IL-2，不加会死的。

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问细胞逐步冻存，放置时间稍长有问题吗？

我是金博士

既然要求-20°20min，那你为啥40min呢？这个时间是个经验值，具有普适性，但也不排除个体差异性，看看细胞有没有破坏，就知道这样行不行了，20min只是个大概值，你可以比较一下嘛，就有结果了。

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问复苏后第二代死亡是为什么？

yyygo

CHO细胞，做稳定转染，为何不加MTX筛选呢？这样不能保证细胞是单克隆啊，如果是细胞瞬时转染表达的话，瞬时快速不需压力筛选

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问为什么会出现自发性荧光？

loyh

所有细胞都会有不同强度的自发荧光，自发性荧光与细胞内的NADH、核黄素等成分所引起的，这些成分可以被蓝光所激发，发射光波谱大约500-700nm范围，与几种常用的荧光染料，如FITC/PE等的发射波谱有一定的交叉！它的波峰为绿光，因此与FITC发射波谱重叠最多。

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问细胞冻存后复苏后的最佳接种浓度?

fyydnz

好久没做实验了，但把我依稀记得的细胞冻存复苏的心得说一下吧！个人觉得没有统一的规定说一管冻存的细胞可以复苏几瓶。首先得看你当时冻存细胞的状态，数量等，要是“种子”不行的话，你后面再怎么复苏，细胞状态也不会好的！再者当复苏后，当离心去除冻存液之后，用培养基吹打开细胞后，可以用肉眼观察下大概细胞浓度，如果觉得细胞浓度很高，可以适当多接种几瓶，要是浓度很低的话，那就少接种，有个一瓶就够了。第三，接种后

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问为什么要使用无血清培养基？

JMZ贝雷帽

避免细胞本身的增值对实验造成的影响

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