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科研学霸天团，48小时有问必答

问怎样提高原代乳小鼠心肌细胞的得率？得到更多跳动的心肌细胞？

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用多聚赖氨酸预包被处理培养皿,采用两步法(0.25%胰酶4℃过夜,0.5 mg/m L-1.0 mg/m L II型胶原酶+5 mg/m L白蛋白的胶原消化液37℃短时多次消化),通过差速贴壁70 min+5-溴脱氧尿嘧啶的使用来纯化心肌细胞.倒置相差显微镜下观察心肌细胞形态变化,台盼蓝染色法检测细胞存活率,α-actinin特异性免疫荧光染色鉴定心肌细胞并计算纯度.结果心肌细胞形态良好,自发搏动

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问乳腺癌细胞中有一些小黑点，是黑胶虫吗？应该怎么办？

Summeryi

正常情况下，细胞也会产生一些小碎片呈现为黑色。还是要观察黑色的点点是否在运动，并且注意细胞的状态

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问如何给文献作者发邮件借文献中用的细胞系？

Eason老歌迷

如果是国外的，还得是自己学着做。如果是国内的可以试着找联系方式，发邮件问一下。

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问原代猪肺巨噬细胞最长可以培养多长时间，有传代的可能吗

Eason老歌迷

一般都是原代培养。如果养的好，可以存活差不多两到三周吧。

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问关于瞬转，目前质粒已经构建好，但是使用转染试剂性价比不高，请问有推荐的吗？

Omiget12

建议可以用慢病毒包装，我们经常做还是可以的。转染向Lipo这些价格太高了，没有必要，可以用些性价比比较高的就行。可以查一下Omifection这款产品。

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问细胞冻存推荐密度是多少？如何配置所需冻存液

Eason老歌迷

冻存液的大致的配置方法：冻存液=10% DMSO + 90% FBS。但是呢，这个比例，各个实验室都是不一样的，因人而异吧推荐细胞数100-300万／ml

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问MTT的OD值有的说要在0.1-0.7，有的说要在0.8-1.2之间，到底要在什么范围呀，求指导！

bamboopiggy

这个只要能说明你实验的问题，没有必要太纠结，差不多0.5-1.0就可以

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问细胞没有污染，但经常有漂浮的细胞的原因

番茄炒蛋不加番哈哈

会不会是细胞的状态不好呢？如果是需要基质胶的，也可能基质胶不行吧，我不专门养细胞，有限的认知只能到这一步啦！

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问细胞培养出现蜂窝状是什么原因

Eason老歌迷

是不是细胞老化呢?如果出现细胞老化，就会有增殖减弱，贴壁能力减弱你可以用细胞衰老检测试剂盒染色，来判断一下

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问拟南芥T3代悬浮细胞，第九天显微镜镜检全部死亡了，温度和光照自己摇床速率都是正常的，本人第一次养细胞，想问下大家这是什么原因呢？

Eason老歌迷

别着急，遇到这种情况，先观察一下细胞的形态，来大致判断一下是什么原因导致的。如果培养基变黄，可能是营养不足，需要你及时更换。同时也可能是细胞污染，主要是细菌污染，支原体污染，黑胶虫污染，病毒污染等，

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问如何从细胞形态学上准备判断细胞是否已经老化了。

Eason老歌迷

可以使用细胞衰老检测办法。每张片子镜下计数四百个细胞，确定X-Gal染色阳性细胞（衰老细胞）在细胞群体中的所占的百分比即衰老细胞率（蓝染细胞数/总计细胞数×100%）。即可算出。

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问细胞支原体污染如何治疗与预防

Eason老歌迷

如何避免支原体污染:首先肯定是要做好细胞间消毒，确保操作时没有污染，做到正确操作，确保你的细胞培养操作器械无菌，可以在培养基中加入适量抗生素。出现支原体污染该如何应对:对于非重要的细胞，如培养中的细胞、WCB的细胞等，将培养物与用过的培养基灭活后丢弃即可。比较重要的细胞，用清洗纯化法清除支原体污染。

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问细胞抱团该如何处理？

Eason老歌迷

如果是贴壁很牢固的细胞，可以多批多次进行消化，这样可以很大程度降低胰酶对细胞的损伤，避免细胞抱团。不要整太高的细胞密度，细胞生长密度过高也比较容易形成细胞成簇，百分之七十到八十的密度就好，这样可以降低细胞抱团的几率。如果是肉眼可见，可先让细胞静置30秒左右，然后吸取上半部分没有抱团的细胞悬液来传代。如果细胞抱团肉眼不可见，也没啥好办法，重新培养吧

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问细胞不贴壁，怀疑是血清的问题，更换血清后，效果依然不好，还可能是什么原因导致的？

Eason老歌迷

细胞不贴壁有很多种原因导致的，你可以从多个角度来看。比如说是不是胰蛋白酶消化过多啊？是不是存在细胞污染，比如说支原体污染啊。或者你的培养基的问题，培养基pH值过碱；还有接种细胞起始浓度太低或太高啊。等等都可能引起

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问在对细胞进行梯度给药给药时，母液是用水配的，浓度过低，那么在用培养基稀释药物时，细胞最低能接受稀释多少倍才能保证渗透压不受影响？

Eason老歌迷

这个要自己先算好浓度，稀释时可以用培养基，加多少量自己一定要算好。绝大多数细胞对渗透压有一定耐受性。就拿人的来说吧，人的血浆渗透压约为290mOsm/kg, 可视为培养人体细胞的理想渗透压。而对比来看，鼠细胞渗透压则是在320mOsm/kg左右。对于大多数哺乳动物细胞，渗透压在260－320mOsm/kg的范围都适宜。

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问细胞污染时都会有哪些现象

bamboopiggy

长的速度变慢，细胞出枝叉，液体容易变黄，液体中有小点点，液体中有絮状物

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问细胞培养过程中，细胞周围包括细胞上有很多小黑点，怎么办?

Eason老歌迷

看到有小黑点，可以这样做:先要用肉眼去观察培养基是不是混浊。然后在镜下观察培养细胞生长的状态，黑点是不是能游动。如果细胞被污染，微生物则会大量繁殖，培养基就会迅速变黄、变混浊。污染包括细菌污染、支原体污染等。培养原代细胞中出现小黑点，可能是原代组织中的杂质，多次传代可以消除。

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问HEK293细胞或CHO-K1细胞在摇瓶培养

Eason老歌迷

第一，换液时动作要轻。第二，293细胞在低代时容易贴壁，生长良好，在传到几十代以后，易聚集成团，且贴壁不牢，用PBS冲洗时即可能脱落，即使消化后也不容易吹打成单细胞悬液。第三，刚复苏的293贴壁很慢，复苏接种后24小时内,应尽量减少观察细胞次数或不作观察,以免因晃动而影响细胞贴壁。复苏后48小时左右观察贴壁情况并进行首次更换培养基比较合适。

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问DF1细胞张速过快，怎么办？

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1.降低细胞密度2.培养基血清降一下

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问提小鼠原代肺成纤维细胞三个月一直是长着长着细胞就死了

Eason老歌迷

你可以试试以下方法：1. 配制0.25%的胰酶，-20度冻存，用时取出，37度水浴温浴。然后将其pH值调至7.0左右，因为胰酶在碱性环境中，消化作用最强。2. 取出细胞把原液倒出，用D-Hanks洗2/3次以去除残留的血清等抑制胰酶消化的因素，加2-3ml经预热的0.25%的胰酶。轻轻晃动瓶子，使瓶中细胞都能接触倒胰酶。倒置显微镜下观察，如果见到细胞变圆，间隙增大（时间约为2分钟）时，倒掉胰酶，用

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