跪求 酵母三杂交具体实验方法

实验步骤：

一、引入 RNA 质粒和 cDNA 文库

二、通过克隆颜色去除不依赖 RNA 的假阳性

三、β-Gal 活性分析

四、纯化 RNA 质粒再次检测

五、用突变和对照 RNA 确定结合的特异性

六、鉴定阳性 cDNA

七、功能测试或其他筛选

这个过程挺长的，我给你简单说一下，然后具体的你自己上丁香通去查。第一步，酵母感受态细胞制备方法和质粒与文库的转化方法，我用的是liac法进行酵母感受态细胞的制备。第二步，通过克隆颜色去除不依赖 RNA 的假阳性。第三步，β-Gal 活性分析，这是为了确证包含 cDNA 的白色克隆通过酵母三杂交激活，需要检测 lacZ 基因的表达水平，可以用ONPG 法。第四步，纯化 RNA 质粒再次检测在第二步的 “通过克隆颜色去除不依赖 RNA 的假阳性” 中利用克隆颜色筛选可以消除绝大多数但并非全部不依赖 RNA 的假阳性。为了确定阳性确实为 RNA 依赖的，RNA 质粒需要 URA3 抗性筛选。第五步，用突变和对照 RNA 确定结合的特异性。第六步，鉴定阳性 cDNA，从酵母细胞中提出显示出预期 RNA 结合特异性的 cDNA 质粒，转化到 E.coli 中。