• 我要登录|
  • 免费注册
    |
  • 我的丁香通
    • 企业机构:
    • 成为企业机构
    • 个人用户:
    • 个人中心
  • 移动端
    移动端
丁香通 logo丁香实验_LOGO
搜实验

    大家都在搜

      大家都在搜

        0 人通过求购买到了急需的产品
        免费发布求购
        发布求购

        求助|red同源重组,打靶片段连接不上

        相关实验:TALEN 敲除基因

        user-title

        dxy_h3mrv7jr

        我要敲除的基因bp为312,out全长为1012bp,打靶片段长度为1496bp,将pkd4的打靶片段电转进感受态以后,过夜培养(37℃),抗性平板上可见单菌落,挑取单菌落于kan+的培养基里过夜培养(37℃)也变浑浊,粗提DNA用欲敲除基因的out引物pcr扩增,电泳,结果跑出来的条带和阳性对照组一样(没有导入打靶片段的感受态),且条带为1000左右,我就怀疑打靶片段没链接上去,求大佬帮我看看究竟怎么回事。

        打靶片段就是,欲敲除基因的前、后各50bp+酶切位点20bp,共70bp,为引物,提取的pkd4质粒为模板,高保真酶扩增后,胶回收得到的东西,胶回收浓度为118。

        下图是我今天跑的验证,最后两条通道为阳性对照。maker是10000的,正常连接上,条带应该在2000上面。

        因为我的菌在kan抗性板上生长了,但是又由于p出来的条带就是out全长的部分,所以我怀疑是不是pkd4打靶片段导了进去,但是没有连接上。求求大佬们帮帮孩子吧,真的走投无路了。

        图片描述

        wx-share
        分享

        1 个回答

        user-title

        Eason老歌迷

        有帮助

        可能有几个原因,red同源重组失败一般是因为DNA链断裂,还有可能是是同源臂太短(<13 bp)没有连接活性,连接不稳定,会断开。或者是同源臂不在载体末端,重组酶切不到可以连接的序列位置,连不了

        ad image
        提问
        扫一扫
        丁香实验小程序二维码
        实验小助手
        丁香实验公众号二维码
        扫码领资料
        反馈
        TOP
        打开小程序