细胞免疫化学染色步骤有哪些？

细胞免疫化学染色的主要步骤包括:

1. 细胞爬片制备:将细胞铺展在玻片上,可以制成悬液滴片或细胞爬片。

2. 固定:使用甲醛或乙醇等固定液固定细胞,保持细胞形态和目标抗原。

3. 渗透处理:使用 Triton X-100 等渗透剂增加细胞膜通透性,让抗体进入细胞。

4. 封闭:使用牛血清等封闭液,封闭非特异性抗原结合位点。

5. 一抗孵育:加入特异性一抗,与目标抗原特异性结合。

6. 二抗孵育:加入标记的二抗,与一抗结合显色。常用标记有酶标记、荧光标记等。

7. 彩现:加入底物显色,如DAB显色。或直接荧光观察。

8. 复染:如用血红素对细胞进行反染,观察细胞形态。

9. 封片:加盖玻片,封固样本。

10. 镜下观察:通过光镜或荧光镜观察结果。

按照这些步骤,可以完成细胞的免疫荧光或免疫组化染色。

1.取出细胞切片，迅速放入冷丙酮中固定20-30分钟。

2.在蒸馏水中浸泡两次，每次约5分钟。

3.在冲孔液中浸泡5分钟。 4.在蒸馏水中浸泡两次，每次约5分钟。

5.使用普通血清密封：从染色罐中取出切片，擦去切片背面的水分和切片正面组织周围的水分（以保持组织湿润），并添加正常的山羊血清或兔血清（与二抗相同）动物血清）处理，并在37°C下保持约15分钟。

6.再次添加一抗：用滤纸吸收血清，无需洗涤，直接在37℃下添加一抗约2小时（也可以在4℃的冰箱中放置过夜）。

7.在PBS缓冲液中：5分钟，2次（置于摇床上）。

8.在37℃，40分钟内逐滴添加生物素化的二抗。

9.在PBS缓冲溶液中：约5分钟，2次（置于摇床上）。

10. 37℃40分钟，再次滴加第三抗体（SAB复合物）。

11.在PBS缓冲溶液中：5分钟，2次（置于摇床上）。

12. DAB显色，在显微镜下观察，并及时终止（终止自来水冲洗）。

13.用自来水（纯净水）彻底冲洗。

14.苏木精复染，室温下30秒钟，用自来水冲洗。

15.用自来水冲洗15分钟，以恢复蓝色。

16.梯度酒精脱水：80％，2分钟，95％，2分钟，100％，2次，5分钟。

17.二甲苯透明：I和II（二甲苯）各5分钟18.安装：加拿大胶（或中性胶）。

细胞爬片铺板→处理细胞→固定细胞→孵育抗体→清洗细胞→观察

细胞固定，破膜，封闭，一抗孵育，二抗孵育，染核，观察