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        细胞的免疫化学实验(ICC)

        相关实验:免疫荧光技术

        最新修订时间:

        简介

        免疫细胞化学与免疫细胞荧光两者实现的实验目的相似,但各有优缺点

        方法比较

        方法 优点 缺点
        免疫细胞化学 样品可长期保存 一次只能标记一种蛋白
        免疫细胞荧光 步骤较简单,可同时标记不同蛋白,图片观赏性强 样品保存时间较短

        原理

        利用抗原-抗体特异性结合的原理,一抗与样本中目标蛋白发生特异性结合,而能够与一抗特异性结合的二抗上连接有显色剂(荧光素、酶、金属离子、同位素),显色剂能够与显色底物结合并促使其染色,进而对细胞内抗原进行定位、定性及相对定量的研究。

        用途

        1、在临床上,用于病理诊断;

        2、其结果可视化,能够定位目的蛋白的表达及位置(弥补 Westernblot 的不足);

        3、从现象出发,揭示机制;

        材料与仪器

        1、样品:贴壁细胞;

        2、试剂:4% 多聚甲醛,PBS,Triton X-100、BSA、一抗、生物素二抗、封片剂;

        3、器材:6/12/24 孔板、细胞爬片(盖玻片)、载玻片、湿盒。

        步骤

        1)按照实验要求,将细胞植于含有细胞爬片的细胞培养板,置于细胞培养箱培养;

        2)植于孔板的细胞稳定过夜后,分组加药处理,到达时间后,弃掉细胞培养液,用 PBS 清洗 3 次每次 5 min;

        3)加入 4% 多聚甲醛进行固定,15~20 min 后使用 PBS 清洗 3 次每次 5 min;

        4) 使用 0.1% 的 Triton X 100 打孔 10min,使用 PBS 清洗 3 次每次 5 min;

        5) 使用 0.3% 的双氧水去除内源性过氧化物酶 30 min,PBS 清洗 3 次每次 5 min;

        6) 使用 PBS 配制 5% 的 BSA 溶液,每孔 400~500 μL 加入目标孔中,室温进行封闭1 h;

        7) 吸出封闭液,加入稀释的一抗,以每孔 200 μL 加入目标孔中,4 ℃ 过夜;

        6) 吸出一抗,PBS 清洗目标孔 3 次× 5 min。加入生物素二抗孵育 1 h;

        7) 吸出二抗,PBS 清洗目标孔 3 次× 5 min。加入 SABC 孵育 1 h;

        8) 吸出 SABC,PBS 清洗目标孔 3 次×5 min。加入DAB 显色 3-5 min;

        9) 吸出 DAB,PBS 清洗目标孔 1 次,将细胞爬片片取出,封片,显微镜观察,拍照。

        注意事项

        1、细胞孔板铺细胞爬片时,用 PBS 清洗细胞爬片,并用枪头轻柔均匀往下压下细胞爬片,赶走爬片与孔板间空气,以免细胞在爬片与孔板间贴壁生长;

        2、为防止细胞脱片,可预先用多聚赖氨酸处理细胞爬片;

        3、参考抗体说明书使用抗体稀释比例;

        4、一抗孵育选择 4 ℃ 过夜孵育,样品置于湿盒;

        常见问题

        1、信号弱或者无信号:

        1)细胞或组织样本保存时间过长;

        2)抗体浓度不合适,孵育时间不足:参照抗体说明书的适当提高稀释浓度,延长孵育时间,建议 4 ℃ 过夜孵育;

        3)试剂过期或失效,更换试剂;

        2、高背景:

        1)封闭不充分,适当延长封闭时间;

        2)抗体浓度过高;

        3)抗体孵育时间过长或温度过高;

        4)清洗不充分,每步清洗 3 次每次 5 min,置于摇床清洗;

        3、非特异性染色:

        1)实验步骤错误,重复实验并设立阳性对照组;

        2)组织中无抗原:设阳性对照以验证试验结果。

        来源:丁香实验

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