请问BDNF与IBA-1荧光共定位做不出来的原因是什么？

主要考虑是二者的二抗选择不合理导致。建议重新选择二抗试试。

1.一抗过夜后室温平衡半小时，二抗可以37度1h，2..如果染核的话用DAPI 5分钟，3..加入二抗后，必须避光操作，减少荧光淬灭。

从您提供的信息来看,IBA-1一抗染色失败的原因很可能与二抗的选择相关。

首先,BDNF一抗为免疫来源,采用488标记的羊抗鼠二抗,这种搭配是非常经典和可靠的。所以BDNF染色成功预期应该较高。

而IBA-1一抗为羊来源,采用cy3标记的驴抗羊二抗。驴抗羊二抗的亲和力和特异性会稍低于羊抗鼠二抗,这会一定影响IBA-1的染色效果。

更关键的是,尽管采用5%驴血清进行封闭,但羊抗鼠二抗和驴抗羊二抗都来自大动物,二者的交叉反应和非特异性结合的机会较大。尤其是在红荧光激发和发射波段下,cy3的荧光信号较强,易造成高背景和假阳性,这可能使IBA-1的阳性信号难以检测。

所以,IBA-1染色失败的可能原因是:

1. 驴抗羊二抗的亲和力和特异性稍差,影响染色效果。

2. 羊抗鼠二抗和驴抗羊二抗易发生交叉反应或非特异性结合,导致高背景和假阳性。

3. cy3的强荧光增强了上述效应,使真阳性信号难以观察。

改进方法可以从以下几点入手:

1. 可选用亲和力更高、特异性更好的抗羊二抗,如兔抗羊二抗。

2. 加大血清稀释度,如10%甚至更高,以进一步减少非特异性结合。

3. 可选用其他荧光通道的二抗,如Alexa Fluor 647,可以避开cy3的 excitation/emission 波段,减少非特异性染色。

4. BDNF染色采用cy3标记的二抗,而IBA-1采用Alexa Fluor 647标记的二抗,完全避开通道之间的交叉反应。

5. 增加阴性对照组,同时进行阴性对照染色,以排除操作过程中产生的非特异性 False Positive 信号。

6. 重复实验,尝试不同条件,找出最佳的染色方案。