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        细胞共定位

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        10447

        实验试剂

        高保真聚合酶(pfu ultra),限制性内切酶(XhoI、SpeI、BamHI、SpeI、SacI),金粉,无水乙醇,2.5MCaCl2 ,20ul 0.1M亚精胺

        实验设备

        PCR扩增仪,PDS-1000/He型基因枪,激光共聚焦显微镜(Carl Zeiss LSM 510 )

        实验材料

        洋葱

        实验步骤

        1. 载体的构建

        pA7- CFP- AtCOP1,pA7-AtCRY1-YFP

        pA7- CFP-OsCOPl,pA7-OsCRY1b-YFP

        中间载体pA7-CFP和pA7-YFP为本实验室构建。将AtCOPl(引物为AtCOP1XhoI5' 和AtCOP1 SpeI3')和AtCRYl(引物为AtCRY1XhoI5'和AtCCT1SpeI3')分别用高保真聚合酶(pfu ultra)进行PCR扩增,纯化PCR产物,用XhoI/SpeI双酶切后,分别连接入pA7-CFP和pA7-YFP的多克隆位点上,得到pA7-AtCOP 1-CFP,pA7-AtCRYl-YFP。

        将OsCRYlb用高保真聚合酶(pfu ultra)进行PCR扩增(引物为OsCRY 1 bBamHI5'和OsCCTlbSpeI3'),纯化PCR产物,用BamHI/SpeI双酶切后连接入pA7-YFP的多克隆位点中,得到pA7-OsCRYlb-YFP。

        将嵌合的OsCOPl用高保真的聚合酶(pfu ultra)进行PCR扩增(引物为AtCOP1XhoI5'和 OsCOP1SacI3'),纯化PCR产物,用XhoI/SacI双酶切后连接入pA7-YFP的多克隆位点SalI/SacI中,得到pA7-OsCOPl-CFP。所有克隆经DNA测序正确后使用。

        2. 基因枪操作

        1) 微弹制备(金粉母液制备)

        a. 称取60mg(或3mg)金粉加入Eppendorf管。

        b. 加入1mL(或50uL)无水乙醇,振荡lmin,10,000rpm离心l0s。

        c. 弃上清,加入1mL(或50uL)无菌水,振荡lmin,10,000rpm离心l0s。

        d. 弃上清,加入1mL(或50uL)无菌水,振荡1 min,-20℃保存。

        2) DNA的包裹

        a. 取50uL金粉悬液于Eppendorf管。

        b. 依次加入5uL质粒DNA (1ug/ul),50ul 2.5MCaCl2 和20ul 0.1M亚精胺(每加完一样,振荡2-3秒)。

        c. 振荡3min,10,000rpm离心10-20秒,弃上清。

        d. 加250ul无水乙醇,振荡重悬,10,000rpm离心10-20秒,弃上清。

        e. 用60ul无水乙醇定容(需重悬)。

        3) 基因枪操作

        a. 基因枪轰击的前一天将新鲜洋葱的鳞叶切成小块(3-5cm长宽),置于MS培养基上培养过夜。

        b. 轰击之前将洋葱的内表面朝上,用PDS-1000/He型基因枪将上述质粒轰击入洋葱内表皮,黑暗培养24h。

        c. 激光共聚焦显微镜观测(Carl Zeiss LSM 510 )。

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