求助！求一个RAW264.7巨噬细胞极化CD86和CD206流式双染protocol

以下是一个基本的RAW264.7巨噬细胞极化的CD86和CD206的流式双染实验协议。请注意，该协议可能需要根据实验条件和实验室特定要求进行优化和调整。

材料：

- RAW264.7巨噬细胞

- 细胞培养基（适当的培养基根据实验需求选择）

- 胶体金标记的抗CD86抗体

- 荧光标记的抗CD206抗体

- 细胞染色缓冲液（如PBS）

步骤：

1. 将RAW264.7巨噬细胞培养在适当的培养基中，使其达到适当的细胞密度（通常70-80%的密度）。

2. 将细胞收获并离心（速度和时间根据细胞类型和实验要求确定）。

3. 弃掉上清液，并用冷细胞染色缓冲液洗涤细胞一次，然后再次离心。

4. 弃掉上清液，并用冷细胞染色缓冲液悬浮细胞，使其达到所需浓度。

5. 取适量的细胞悬液加入到离心管中，使每个管中含有所需数量的细胞。

6. 向每个管中加入适量的胶体金标记的抗CD86抗体和荧光标记的抗CD206抗体（按照供应商推荐的浓度进行优化，也可根据实验要求自行优化），轻轻混匀。

7. 在4°C条件下，孵育细胞和抗体混合物，保护细胞表面抗原的完整性，一般孵育时间为30分钟至1小时。

8. 孵育结束后，使用冷细胞染色缓冲液洗涤细胞一次，然后离心。

9. 弃掉上清液，并使用冷细胞染色缓冲液再次洗涤细胞一次，然后离心。

10. 弃掉上清液，小心地将细胞悬浮于适量的细胞染色缓冲液中。

11. 将细胞悬液转移到流式细胞术管中，并通过流式细胞仪进行分析。