电化学发光免疫测定

第1步：耦联有活化的三联吡啶钌衍生物即[Ru(bpy)3]2+N—羟基琥珀酰胺酯(NHS)的TSH抗体和结合了生物素的TSH抗体与待测血清同时加入一个反应杯中孵育。 第2步：将被链霉亲和素包被的磁珠加入反应杯中，再次孵育，使生物素与亲和素的结合，将磁珠、TSH抗体连接为一体，形成双抗体夹心。 第3步，蠕动泵将形成的[Ru(bpy)3]2+抗体—抗原—抗体—磁珠复合体吸人流动测量室，此时，磁珠被工作电极下面的磁铁吸附于电极表面。同时，游离的TSH抗体（与生物素结合的和与[Ru(bpy)3] 2+结合的抗体)也被吸出测量室。 紧接着，蠕动泵加入含三丙胺(TPA)的缓冲液，同时电极加电压，启动ECL反应过程。 发光剂[Ru(bpy)3]2+和电子供体TPA在阳极表面，可同时各失去一个电子而发生氧化反应，使2价的[Ru(bpy)3] 2+被氧化成3价，后者是一种强氧化剂；另一方面，TPA被氧化成阳离子自由基TPA…，后者很不稳定，可自发失去1个质子(H+)，形成自由基TPA·，这是一种很强的还原剂，可将1个电子给3价的[Ru(bpy)3)3] 2+，使其形成激发态的[Ru(bpy)32+，而TPA自身被氧化成二丙胺和丙醛。 激发态的[Ru(bpy)3] 2+通过荧光衰减机制，发射出一个波长620nm的光子，重新生成基态的[Ru(bpy)3] 2+。该过程在电极表面周而复始地进行，产生许多光子，光电倍增管检测光强度，光强度与[Ru(bpy)3] 2+的浓度呈线性关系，故可测出待测抗原的含量。