流感病毒对MDCK细胞感染后的免疫荧光实验步骤

流感病毒对MDCK细胞感染后的免疫荧光实验步骤大致分为五部分

1.病毒分离标本的采集

2.MDCK细胞分离

3.病毒接种和收获

4.MDCK细胞传代

5. MDCK细胞保存及复苏

具体可以看这篇文章

流感病毒在MDCK细胞中培养的条件优化

一、标本的采集与处理

一标本的采集

1、病毒分离标本的采集

标本采集后应立即放入适当的采样液中低温保存，常用的采样液为：普通肉汤，pH7.4-7.6的Hank‘s、Eagle’s或水解乳蛋白液。主要的采集方法有以下几种：

1鼻拭子

2咽拭子

3鼻咽抽取物

4鼻洗液

5漱口液

2、血清标本采集

血清标本应包括急性期和恢复期双份血清。急性期血样应尽早采集，最迟不超过发病后7天。恢复期血样应在发病后2-4周采集。单份血清一般不能用作诊断。血液标本2000-2500rpm离心15min。收集血清，弃血凝块。血清可在4℃存放一周，长期保存置-20℃。

标本运送

标本应在低温下，24小时内运送至实验室。标本至实验室后，病毒分离标本应尽快进行接种分离，48h内能进行接种的可置于4℃保存，如未能接种应置-70℃或以下保存。血清标本可在4℃存放一周，长期保存置-20℃或以下。

标本处理

二、病毒分离

多用鸡胚来分离流感病毒。

一 MDCK细胞分离

1、实验材料

MDCK细胞、Eagle氏培养液、Hank‘s溶液

0.25%胰酶和Versene消化液、双抗（青、链霉素）或庆大霉素和抗真菌素、胎牛或小牛血清5.6%或7.5%的NaHCO3

2、病毒接种和收获

3、MDCK细胞传代

1.把需用的溶液置室温或37℃水浴中预热。

2.已成片的MDCK细胞，将其生长液倒掉。

3.把Versene与0.25%胰酶按7：1比例配成消化液，每小瓶加入消化液3 ml（加入量应根据瓶大小不同而异）。

4.置37℃恒温箱5-10min，在此期间应在光学显微镜下观察1-2次，当细胞变圆，细胞与细胞间互不相联，表明消化时间已到。如细胞仍连成片，表明消化时间未到。但千万不可消化时间过长，造成大量细胞从瓶壁上脱下，甚至造成破碎。

5.倒掉消化液，每瓶加入9 ml培养液，用毛细吸管将瓶壁上细胞轻轻吹下吹散。吸出6 ml接种2小瓶，3 ml/瓶，将原瓶留下，置37℃恒温箱培养。

6.一般情况下，1瓶细胞传3瓶，如细胞急用，可一传二。不急用，可一传四等。有时为了控制细胞的代数，可一传八，这样一星期传一代就可以了。一般情况每2-3天需传一代。

4、MDCK细胞保存及复苏

MDCK细胞对流感病毒的敏感性随其代数增加而下降，应使用液氮冻存代数较低的细胞作为种子。保存液为含10%二甲基亚砜和90%小牛血清。

1）MDCK细胞保存

2）MDCK细胞复苏

3）MDCK细胞对流感病毒敏感性测试

按照实验过程大致分为两个部分：一：细胞培养。二：细胞固定通透和染色。1，4%多聚甲醛孵育细胞10min。或者用放在-20℃预冷的甲醇孵育5min。这两个都是常规固定液，非常规的也有甲醛，乙醇和丙酮等。2，用提前在4℃或者冰上预冷的PBS洗三次，不要太用力。3，抗原修复。不要惊讶，就是抗原修复。基本上很少有人会这么做，但是细胞免疫荧光里增加了抗原修复的步骤会让抗体更容易染上，很多做不出来的抗体都可以做出来。过程就是碱性尿素缓冲液在95℃水浴10min，自然冷却即可。4，透化。这个步骤取决于你的抗体针对的是不是胞内蛋白，膜蛋白不需要这个步骤。常规透化剂是0.1% Triton X-100的PBS。透化10分钟然后用PBS洗干净。5，封闭。封闭液可以用溶于PBS的BSA或者二抗物种的血清。BSA的浓度只要1%就可以，血清只要10%即可。如果你是用甲醛类做固定液，那么还需要22mg/ml的甘氨酸添加到封闭液里。如果你的一抗结合力很强或者二抗有非特异性结合，那么添加0.1%吐温20。6，用封闭液稀释一抗，4℃过夜孵育。第二天用PBST清洗三遍后避光。孵育二抗，二抗浓度大约1抗的十倍。最后染DAPI（1ug/ml）1分钟。7，PBS洗三遍，用抗淬灭封片剂封片。边缘处滴两滴指甲油。就可以拍照了。