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        流感病毒的MDCK细胞分离方法

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        一、目的

        流感病毒的MDCK细胞分离方法是流感实验的关键技术,用于流感病毒的分离、培养。本SOP是为确保MDCK细胞分离流感病毒的操作准确、规范和可靠而制定。

        二、范围

        适用于实验室所有技术人员进行流感病毒的MDCK细胞分离。

        三、程序

        (一)生物安全要求

        H5,H7亚型高致病性禽流感病毒,H2N2亚型流感病毒的MDCK细胞分离实验室生物安全级别:BSL-3。实验操作人员需进行BSL-3防护,具体详见“生物安全个人防护SOP”。H5,H7亚型高致病性禽流感病毒,H2N2亚型流感病毒的MDCK细胞分离操作必须在BSL-3级实验室的生物安全柜中进行。

        其余流感病毒的MDCK细胞分离实验室生物安全级别:BSL-2。实验操作人员需进行BSL-2防护,具体详见“生物安全个人防护SOP”。其余流感病毒的MDCK细胞分离操作必须在BSL-2级实验室的生物安全柜中进行。

        (二)材料

        1、75%~90%成片的MDCK细胞,选用合适大小的细胞培养瓶和细胞培养板来用做病毒分离

        2、胰酶(牛胰腺来源Ⅷ型)

        3、HEPES缓冲液,1M母液

        4、D-MEM培养基,Hank's液

        5、青、链霉素母液(10000U/mL 青霉素G;10000µg/mL硫酸链霉素

        6、牛血清白蛋白组分Ⅴ,7.5%溶液

        7、临床样品0.5mL

        8、1mL无菌移液管

        9、10mL无菌移液管

        10、15mL无菌离心管

        (三)实验步骤

        1、准备病毒生长液

        (1)细胞维持液准备

        500mL D-MEM液中加入

        ①青、链霉素母液 5mL(终浓度达:100U/mL青霉素;100µg/mL链霉素)

        ②牛血清白蛋白组分Ⅴ 12.5mL(终浓度:0.2%)

        ③HEPES缓冲液 12.5mL(终浓度:25mM)

        (2)病毒生长液

        每500mL细胞维持液中加入0.5mL的TPCK-胰酶(母液浓度为2mg/mL)使TPCK-胰酶的终浓度为2µg/mL。

        2.流感病毒MDCK细胞分离步骤:

        (1)75%~90%成片细胞的准备,以选取T25细胞瓶为例。

        ①用40×物镜观察细胞生长状态。

        ②轻轻倒出细胞生长液,用10mL的无菌移液管吸取6mL Hank's液分别清洗细胞3遍。

        (2)细胞培养瓶的接种

        ①用无菌的移液管将清洗细胞的Hank's液从细胞培养瓶中移出。

        ②用无菌的移液管吸取适量临床标本置于细胞培养瓶中,温和摇动数次。

        ③然后放于37℃,5%CO2培养箱中吸附1~2h。

        ④吸出接种物,用10mL的无菌移液管吸取6mL Hank's液分别清洗细胞2遍。然后加入6mL病毒生长液于细胞培养瓶中。

        ⑤放置于33~35℃培养箱培养。

        ⑥每日观察细胞病变情况。(细胞病变的特征是细胞肿胀圆化,细胞间隙增大,细胞核固缩或破裂,严重时细胞部分或全部脱落)。

        (3)细胞培养物的收获

        当75%~100%细胞出现病变时进行收获,收获之前可以将细胞放于-70℃冰箱,冻融1~2次,以提高收获标本的病毒滴度。即使无细胞病变也应该于接种后第7天收获。收获病毒液时,先温和摇动细胞瓶数次,然后用10mL的无菌移液管吸取病毒液置于15mL无菌离心管中,混匀病毒。收获的病毒液可以立即进行后续试验,或冻于-80℃冰箱待以后试验使用。

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