变性时上样缓冲液加少了，有影响吗

再补点进去，就好，问题不大。实在不放心就重新变性一下

建议把反转录时间加长，比如原本是42℃半小时，现在搞到1小时，因为，BUFFER里含有Mg离子这个是辅酶（生化书里有辅酶的比较完整介绍），你现在加少了，反转录酶的活性没有平时高，但加的少一点没啥关系，它活性没达到最大，你把时间延长就可以了。

上样缓冲液量少，会使蛋白解聚效果差，目的条带释放不出来。