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        🔥 菌落免疫印迹法

        相关实验:免疫印迹(immunoblotting)

        别名:colony immunoblotting

        最新修订时间:

        丁香实验推荐阅读

        合作专家 | 郭新容硕士

        临床医学 中南大学

        丁香实验推荐阅读

        审核专家 | 郭雅婕博士

        生物化学分子生物 中国科学院大学

        简介

        菌落免疫印迹法是通过抗体与目标抗原(通常是细菌的表面抗原)结合的免疫化学反应,形成可见的免疫印迹,来检测和鉴定目的抗原。

        用途

        用于快速检测和鉴定微生物菌落的种类和数量,以及判断微生物的毒力和抗原性。

        材料与仪器

        细菌培养液,玻片,PVDF 膜或 nitrocellulose 膜,BSA,TBST,免疫血清,标记抗体,显微镜,培养平板,蛋白浓度测定试剂,离心管等。

        步骤

        菌落免疫印迹法检测目标抗原的步骤如下:

        1、菌落培养:在含有适宜营养物质的琼脂平板上,接种要检测的菌株,并在适当的温度和时间下培养到菌落形成。将待分析的细菌菌株在培养基上培养至对数期阶段,培养条件为 37 ℃ 培养 12~16 小时。

        2、取得细菌菌落:用悬针或小枪头从培养基上捞取单个菌落,涂抹在微型培养基(直径 90 mm)上。继续培养至菌落变大直径约 5 mm。

        3、菌落裂解:加入 50 μl 的菌落裂解液(例如含有蛋白酶和 EDTA 的 Tris 缓冲液),裂解菌落,使其释放出细胞内蛋白质。

        4、蛋白质定量:用比色法或其他方法测量裂解液中的蛋白质浓度,通常使用 BCA 测蛋白浓度试剂盒。

        5、SDS-PAGE 电泳:

        根据蛋白质大小,将菌落裂解液中的蛋白质进行 SDS-PAGE 电泳分离。将分离后的蛋白质转移到 PVDF 或 nitrocellulose 膜上。

        6、膜上免疫印迹:将膜浸泡在 5% 的非脂奶粉或 3% 的 BSA 的 TBST 缓冲液中,以防止非特异性结合。然后用特异性抗体与目标蛋白质进行孵育,4 ℃ 孵育过夜或室温孵育 2 小时。孵育后,回收抗体,含有目标蛋白的膜用 TBST 洗涤 3 次,每次 8 分钟。

        7、检测:用辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶等酶标记的二抗与特异性抗体结合,结合条件为室温水平摇床孵育 2 小时。孵育结束后,用 TBST 洗涤膜 3 次,每次 8 分钟。通过化学荧光或染色法检测信号,比较不同条件下的目标蛋白的表达。

        注意事项

        1)菌落培养过程种注意无菌操作;

        2)免疫反应的温度和时间要恰当;

        3)各种液体的比例要恰当,避免视觉干扰;

        4)标准菌株和阳性对照应同时设置。

        来源:丁香实验

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