western blot 转膜及条带问题

1.洗膜不充分，增加洗涤液的体积和洗涤次数；在洗涤液中加入Tween=20。

2.二抗浓度过高，引起了一些非专一性的抗原-抗体相互作用，适当降低二抗浓度，可以分梯度进行。

3.二抗的识别抗原免疫簇不唯一，这是因为二抗是多克隆抗体，使用单克隆抗体的二抗，此时二抗的识别抗原免疫簇是唯一的，其非专一性的抗原-抗体相互作用会大为减少。当然，有时，单克隆抗体也会有识别抗原免疫簇不唯一，如果两种蛋白质的抗原免疫簇的结构很相近的话。如果不知道是不是二抗的识别抗原免疫簇不唯一，可以不加一抗的情况下只加二抗实验，可以检测出是否为二抗的的抗原免疫簇的识别的原因，若是的话，可以先更换封闭试剂，若无效，则要同时更换二抗。

1.封闭不充分，增加封闭液的封闭时间，适当提高温度，更换封闭液。

2.曝光过度，缩短曝光时间。

3.检测过程中膜干燥，保持充分的反应液，避免膜干燥。

4．若无别的选择，可尝试选择5%的脱脂奶粉，同时加入Tween=20。

5.滴定一抗或二抗的效价，找到一个产生清晰的信号强度可以接受的较低的抗体浓度。

6.缩短一抗和二抗的孵育时间。

一般这种情况考虑封闭不好造成，楼主可适当延长封闭的温度和时间，可以有效降低背景。此外验证抗体的特异性也非常必要。