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科研学霸天团，48小时有问必答

问ELISA显色失败都有什么原因？

dxy_gwrp7ndq

失败原因：1.包被原：包括你的包被液有无问题，有没有配错。包被原一般加100微升，37度2小时； 2.封闭：封闭液用的是否适合？你说做了几次都没显色，空白孔也不显吗？如果空白也无颜色，那封闭就没有问题。一般封闭是200微升每孔，也可以满孔封闭 3.一抗：检查你的一抗是否失效。是否是在37度反应 4.二抗：底物，底物缓冲液……这些都要好好检查！ 5.洗涤：用PBST洗涤，包被和封

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问chip-seq相关问题？

dxywode

你可以可以试试抗体可以多加点，加到4ug。阴性对照有条带是正常的，属于背景，关键是相对于目的抗体条带很弱才行。建议你做一个阳性chip实验证实你的体系没问题以及抗体没问题然后确定是否你的chip实验结果可信。希望能对你有帮助！

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问为什么ELISA实验中同一样本的复孔会相差很大？如何避免有这样大的差别？

师医生说

在酶联免疫吸附试验，同一样本的复测孔，如果是同一操作者，在相同的实验环境没有发生实验中的交叉污染时，是不会出现吸光度值相差很大的情况。在检测前，一定要对洗板机进行冲洗，另外要严格按照浓度配比进行洗液的配制，要用标准的微量加样器，手法标准的加样，要进行阴性对照，阳性对照和质控品的加样同一化加样。西板的过程也要注意加注洗液的高低一致，同时，拍板要干净，以防交叉污染

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问硫磺素S染色的具体步骤是怎样的呢？

dxy_gwrp7ndq

1．石蜡切片，通过二甲苯和酒精脱蜡至水。2．切片放入0.25％高猛酸溶液中漂染20 minutes 。3.蒸馏水稍洗。4．切片放入白液中漂洗2 minutes 。5．蒸馏水稍洗。6．切片放入封闭液中漂染20 minutes 。7．蒸馏水稍洗。8．切片放入0.25％醋酸液中漂洗5 seconds .9．蒸馏水稍洗。10.将切片裱于载玻片上凉干、玻片保持平放。11．玻片用蒸馏水稍洗。12．滴上硫黄素

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问western blot实验相关问题

dxy_gwrp7ndq

背景深、杂带多原因：1、一抗浓度高了；2、封闭时间短了；3、孵育完二抗之后洗脱时间短了；4、你的蛋白有没有其他亚型；5、你的一抗来源本来就有问题，买之前说明书上面杂带多么。

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问做ELISA时可以两个板只做一条标准曲线吗？

txs900416

除非两个板的特性完全一模一样，每孔之间操作和间隔时间都相同，不然尽量在两个板上分别作标准曲线

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问人群血清IgG 正常值测定示例法的工作原理是什么？

府宅

单向免疫扩散实验——人群血清IgG 正常值测定示例发实验原理：将一定量抗体混匀于琼脂糖凝胶内制板、打孔、在凝胶孔中参加标准抗原溶液或待测样本。抗原在凝胶中向四周呈辐射状扩散并与凝胶中的抗体发生特异性结合反响，在抗原抗体比例适宜处形成白色沉淀环。沉淀环的大小与抗原的浓度成正比。以不同浓度标准抗原液制成标准曲线，通过沉淀环大小（直径）可在标准曲线上査出待测标本中相应抗原的浓度。

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问请问明明BCA定量完了，为什么每次跑出来的GAPDH都不齐呢？还有其他蛋白归一化的方法吗？

今天摆烂了咩

可能因为BCA测定的是组织内总蛋白的量，组织内细胞类型较多的话，测定的某一特定蛋白的浓度会不准确，可以根据各条带的灰度调整下上样量，即调下内参试试。蛋白浓度测定除了BCA法外还有紫外吸收法，双缩脲法，考马斯亮蓝法等等。

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问悬浮细胞的免疫荧光选取抗体时最好如何做选择呢，可以直接做荧光标记吗？

dxy_gwrp7ndq

选取一抗时要来源于两种不同的动物，我用的是来源于 rabbit 和 rat 的抗体，二抗则是不同荧光信号标记的，我用的是 donkey anti - rabbit - FITC （绿）和 donkey anti - rat － Tex - Red （红）。可以直接标记

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问条带为什么跑不出来？

woazan

如果你的抗体没问题（别人跑出来了），那么就是降解的可能性大，蛋白酶磷酸酶抑制剂这些最好换个好的牌子，提取组织蛋白要超声，可以加大上样量与阳性对照

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问买回来的抗体敷育出来的条带为什么会出现跟案例完全不同呢？

dxy_gwrp7ndq

可能是转膜就没转好，或者没洗干净或者没封闭好。而且同一条带曝光多几次结果都可能有差异啦，更何况分开两次跑，影响因素很多的。

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问求教大家一个问题瓶口刻度

师医生说

在实验过程中，注意容量瓶的选择是很重要的，要根据自己液体容积的多少，采用微量加样器或者是量桶。眼睛要平齐液体凹液面，同时，要避免在光线不良的情况和有折射的环境中进行。实验员有同伴的情况，最好是取平均值更为准确

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问关于间接免疫荧光检测凝集素途径激活

dxywode

凝集素补体途径是补体激活的途径之一，由血浆中甘露聚糖结合凝集素（mannan-binding lectin,MBL）直接识别多种病原微生物表面的N-氨基半乳糖或甘露糖，进而依次活化MASP-1、MASP-2、C4、C2、C3，形成和经典途径相同的C3与C5转化酶，激活补体级联酶促反应的活化途径.MBL激活途径的主要激活物为表面含有甘露糖基、岩藻糖和N-氨基半乳糖的病原微生物.

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问组织免疫荧光片子图片杂质比较多，有解吗？

府宅

有些荧光杂点可能是非特异，建议检查一下封闭用的血清或者BSA是否有问题。如果确信荧光杂点不是生物信号，可以利用photoshop，通过调节色阶、通道相减、调节明暗对比度等去掉，但前提是确保足够的信噪比。如果找不到原因的话，还可以尝试将Caspase-3用红色标记，将NEnU用绿色标记，可能会有意想不到的结果。

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问备选方案间标法检测小鼠巨噬细胞表形加入的适量荧光素标记的F(ab)片段的适量有什么标准，或者文献支持吗

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问Th10和Th17如何诱导？

bqejjh123

你可以分别采取以下3种方法体外诱导Th17细胞:①给予CD3及CD28抗体刺激,并在培养体系中加入白细胞介素6及转化生长因子β,培养3d.②在方法①的基础上加入白细胞介素1β及肿瘤坏死因子α,培养3d.③在方法②的基础上第3天洗去细胞因子,培养2d;再次给予CD3及CD28抗体刺激,并在培养体系中加入白细胞介素23,培养3d.

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问复孔之间的误差可以有多大？想同时做两块板，板1做了标曲，板2可以省掉不做，以板1上的标曲为准吗？

府宅

复孔直接的OD值差别一般应在0.1－0.15。这两板在标准曲线方面的表现是一致的，其他检测步骤对标准曲线的绘制没有影响，如果这样的话，就可以用一个

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问免疫共沉淀的方法更适用于检测哪种物质？对于样本需要怎么样的处理？新手应该注意哪些方面？需要用到的仪器是哪些？

Kimser

适用于：检测兴趣蛋白质，样本：需要加入细胞裂解缓冲液也就是蛋白酶抑制剂，新手注意：每种细胞裂解条件不同，如果没有人带你，可以做对照实验，还有就是注意不要用太多，多看看说明书要求，注意避免污染仪器：离心机，ep管，离心管，电泳仪，电泳槽，色谱仪，刮刀等

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问加非特异染色阻断剂后是直接甩去即可还是甩去后需要冲洗三次？

dxy_gwrp7ndq

除去PBS溶液，加100μl非特异染色阻断剂，室温下孵育10分钟。即直接甩去，不需要冲洗

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问请问在做western blot,IF,IHC等实验中，二抗可以用鼠二抗吗？

府宅

可以使用鼠二抗，疫学试验中常通过封闭试剂来封闭未吸附蛋白的固相载体部位，以减少非特异性结合背景的影响。如WB 试验中常用5% 脱脂奶粉或者BSA 封闭膜上除转印蛋白占据的其它部位。除了用于封闭未吸附蛋白的固相载体，封闭试剂也被广泛用于封闭其它非特异性结合。如IHC、IF 等试验中，特异性抗体与样本中Fc 受体的结合，以及在IHC 和IF 双染或三染实验中，驴血清也被广泛用于封闭试剂以减少抗体之间的

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