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问
想问一下细胞裂解液选择蛋白酶抑制剂时有什么原则吗?受不受组织来源的影响?胞膜和胞浆有区别吗?
土井挞克树
如果你知道具体的蛋白,比如胰蛋白可以选择胰蛋白裂解剂。如果不知道具体蛋白可以选择广谱的抑制剂
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问
免疫组化和WB可以用同一种抗体吗?
申东熙老伯
可以的,买抗体的时候主要买能做这两种实验的抗体,一般都会标注清楚。
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问
要做磷酸化某因子WB,其二抗有何要求?
balalaLy
二抗没有特殊,关键是一抗要选择对,得能识别磷酸化的
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问
大分子量蛋白200KD或以上,在做WB要注意什么呢?
c_Yeats
1.试试4-20%的梯度胶电泳2.电转过程优化方案,湿转恒流200mA 2.5H,0.45um PVDF膜,一定要多加冰袋制冷。3.可以在Western转膜液加0.1% SDS
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问
做组织样品的WB的时候,怎样处理样品?
balalaLy
确保组织取下来后尽快处理,或者液氮冻存。含血液多的组织还得用生理盐水冲洗一下。将组织块剪碎,然后超声裂解或者液氮研磨。
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问
一般一次上样的蛋白总量是多少,跟目的蛋白的表达量有关系吗?
balalaLy
跟目的蛋白的表达量有关系,目的蛋白表达低,总的蛋白上样量得加大
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问
二抗是生物素化的抗体,三抗是亲和素生物素体系,不知采用这样的方案后,封闭液是否要作调整,能否再用5%的脱脂奶粉呢?
是虈亣靌
不能使用脱脂奶粉,用BSA(5%)代替会好一点。
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问
我所测定的蛋白分子量是100KD左右,按理说分离胶应当采用7.5%,但资料却要求分离胶和浓缩胶均采用11%的配方,不知为何?
土井挞克树
具体可以参考下面的制胶浓度表格。你这个还是适合11%的胶,7.5%也可以跑,不过容易曲线有偏移。
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问
蛋白变性后可以存放多久?
huarenqiang5
-80℃,若没有反复取出冻融,保存一两年没有问题。
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问
裸鼠的免疫功能不全临床表现是什么
彭文彬
雌性裸鼠生育能力极其低下。胸腺發育不良
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问
如果上样量超载,要用什么方法来增加上样量?
balalaLy
换厚的10孔梳子,孔径比较大,可以加到50ul左右
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问
分离的蛋白是分子量200kd的,SDS-PAGE电泳的分离胶浓度多大合适?积层胶的浓度又该用多少?这么大分子量的蛋白容易作WB吗
paj12345
200KD,分离胶浓度8%比较合适,适当延长电泳时间,浓缩胶5%,只要操作得当,WB应该能跑出来。以下是本实验室的配胶成份表:
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问
如果目标蛋白是膜蛋白或是胞浆蛋白,操作需要注意什么?
NatureBios
提蛋白根据蛋白表达位置可以选择对应的裂解液,如提胞浆蛋白的裂解液,提膜蛋白裂解或全细胞裂解液,操作上常规的注意事项那就是冰浴裂解,蛋白酶抑制剂,PMSF(磷酸化蛋白检测时磷酸酶抑制剂cocktail)等
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问
同一蛋白样品能同时进行两种因子的WB检测吗?
juyue2010
可以,在孵育1抗时剪膜,不过要注意两个蛋白要分子量不能接近
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问
同一样品能同时提RNA又提蛋白么?这样对WB有无影响?
土井挞克树
能,完全没有问题;这是两个不同的实验
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问
细胞水平要做WB,多少细胞提的蛋白够做WB?
balalaLy
一般用六孔板,每孔加100-200ul裂解液,上样15ul左右。
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问
请问DAB好还是ECM好?
汤姆卜丽波
如果你的实验条件可以的话,那首选ECM,正常实验来看,灵敏度是够的
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问
做WB时我的目的带很弱,怎么加强?
NatureBios
只要有目的蛋白印迹,后面的都很好办,我们可以在上样量,一二抗的浓度,显影液灵敏度,曝光时间等几个方面着手
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问
做WB有什么方法可以提高上样量?
NatureBios
给样本浓缩,可以用IP富集一下目的蛋白,低电压,让点样孔里面的样本往下跑一跑,再加一些样本等
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853 围观
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问
大分子量蛋白200KD或以上,在做WB要注意什么呢?
balalaLy
用浓度低的胶,比如7-8%的分离胶,然后转膜条件250mA 3小时左右
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