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问
PSD95半定量,计算其平均灰度值时,为什么不直接在原始图中,而是在merge切割通道后选green通道进行计算?
汤姆卜丽波
类似于初始半定量可能会有一些地方是非特异性的,merge之后就会把这些非特异性的去除掉
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问
怎样才能把胶跑的非常漂亮,泳道都能很直,上样的量和灌胶是否很重要,电压有什么要求?
吱昂张_
重要,胶制的均匀好分一点,上样量尽量一样,电压根据分子量调
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问
做Western Blot时,同样的抗体免疫组化能做出,而Western Blot却不能?
balalaLy
要看这个抗体能不能做wb,就算能做,如果表达量很低也是比较难做出来。其次是你这个蛋白如果是核表达的话可能会因为裂解不充分导致蛋白提取失败或者提取量低。
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问
想问一下细胞裂解液选择蛋白酶抑制剂时有什么原则吗?受不受组织来源的影响?胞膜和胞浆有区别吗?
土井挞克树
如果你知道具体的蛋白,比如胰蛋白可以选择胰蛋白裂解剂。如果不知道具体蛋白可以选择广谱的抑制剂
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问
免疫组化和WB可以用同一种抗体吗?
申东熙老伯
可以的,买抗体的时候主要买能做这两种实验的抗体,一般都会标注清楚。
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问
要做磷酸化某因子WB,其二抗有何要求?
balalaLy
二抗没有特殊,关键是一抗要选择对,得能识别磷酸化的
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问
大分子量蛋白200KD或以上,在做WB要注意什么呢?
c_Yeats
1.试试4-20%的梯度胶电泳2.电转过程优化方案,湿转恒流200mA 2.5H,0.45um PVDF膜,一定要多加冰袋制冷。3.可以在Western转膜液加0.1% SDS
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问
做组织样品的WB的时候,怎样处理样品?
balalaLy
确保组织取下来后尽快处理,或者液氮冻存。含血液多的组织还得用生理盐水冲洗一下。将组织块剪碎,然后超声裂解或者液氮研磨。
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问
一般一次上样的蛋白总量是多少,跟目的蛋白的表达量有关系吗?
balalaLy
跟目的蛋白的表达量有关系,目的蛋白表达低,总的蛋白上样量得加大
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问
二抗是生物素化的抗体,三抗是亲和素生物素体系,不知采用这样的方案后,封闭液是否要作调整,能否再用5%的脱脂奶粉呢?
是虈亣靌
不能使用脱脂奶粉,用BSA(5%)代替会好一点。
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问
我所测定的蛋白分子量是100KD左右,按理说分离胶应当采用7.5%,但资料却要求分离胶和浓缩胶均采用11%的配方,不知为何?
土井挞克树
具体可以参考下面的制胶浓度表格。你这个还是适合11%的胶,7.5%也可以跑,不过容易曲线有偏移。
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问
蛋白变性后可以存放多久?
huarenqiang5
-80℃,若没有反复取出冻融,保存一两年没有问题。
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问
裸鼠的免疫功能不全临床表现是什么
彭文彬
雌性裸鼠生育能力极其低下。胸腺發育不良
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问
如果上样量超载,要用什么方法来增加上样量?
balalaLy
换厚的10孔梳子,孔径比较大,可以加到50ul左右
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问
分离的蛋白是分子量200kd的,SDS-PAGE电泳的分离胶浓度多大合适?积层胶的浓度又该用多少?这么大分子量的蛋白容易作WB吗
paj12345
200KD,分离胶浓度8%比较合适,适当延长电泳时间,浓缩胶5%,只要操作得当,WB应该能跑出来。以下是本实验室的配胶成份表:
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问
如果目标蛋白是膜蛋白或是胞浆蛋白,操作需要注意什么?
NatureBios
提蛋白根据蛋白表达位置可以选择对应的裂解液,如提胞浆蛋白的裂解液,提膜蛋白裂解或全细胞裂解液,操作上常规的注意事项那就是冰浴裂解,蛋白酶抑制剂,PMSF(磷酸化蛋白检测时磷酸酶抑制剂cocktail)等
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问
同一蛋白样品能同时进行两种因子的WB检测吗?
juyue2010
可以,在孵育1抗时剪膜,不过要注意两个蛋白要分子量不能接近
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问
同一样品能同时提RNA又提蛋白么?这样对WB有无影响?
土井挞克树
能,完全没有问题;这是两个不同的实验
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问
细胞水平要做WB,多少细胞提的蛋白够做WB?
balalaLy
一般用六孔板,每孔加100-200ul裂解液,上样15ul左右。
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问
请问DAB好还是ECM好?
汤姆卜丽波
如果你的实验条件可以的话,那首选ECM,正常实验来看,灵敏度是够的
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