枯草芽孢杆菌怎么转大质粒，一直转不进去？

我也是，请问楼主用的是化转还是电转，问题解决了吗？

转不进去建议从以下几个方面优化转化步骤:

1. 电转持续时间的把握：最好能控制在4.2ms以上，若出现击穿现象，可将感受态细胞以100μl每管分装，采用2mm电转杯，2500v脉冲。
2. 感受态可以适当的冻存。
3. 平板的抗性可适当降低。
4. 复苏时可以在大试管内复苏，提高溶氧。复苏时可降低转速。
5. 一定要注意原料的纯度，尤其是甘露醇与山梨醇。配出来的RM培养基是暗红色。使用纯甘露醇，才能成功转化。
6.如果需要提高转化率，可是试试在ETM内加入0.5M的海藻糖，挺管用的

要提高枯草芽孢杆菌大质粒的转化效率，需要注意DNA质量、外源DNA的量和比例、处理细胞的方法、转化条件、抗生素的选择和使用等多个因素。

枯草芽孢杆菌质粒转化方法主要有原生质体营养缺陷型突发株染色体DNA转化方法。

可以用原生质体营养缺陷型突发株染色体DNA转化法

转质粒步骤：

1）新鲜平板挑单菌落（小一点为好）接种于5mlLB培养基中，过夜培养.。

2）测量摇管内OD，控制好接种量，使接种完毕后培养基的OD在0.19-0.2之间。培养基为50mlGM。37℃，200rpm培养至OD600=1.0（大约3-4小时）左右。

3）取全部菌液冰水浴10 min，然后5000rpm，8min，4℃离心收集菌体。

4）用40ml预冷的电转缓冲液ETM洗涤菌体，5000rpm，8min，4℃离心去上清，如此漂洗3次。

5）将洗涤后的菌体重悬于等500μl的ETM中，每管分装60μl.

6）将60μl感受态细胞中加入1-6 μl质粒，冰浴孵育5min，加入预冷的电转杯（1mm）中，电击一次。电转仪设置：2.0kv（另外我还尝试过0.8kv，1.2kv）,25μF200Ω，1mm,电击1次. （持续时间4.5ms-5ms之间）

7）电击完毕立即加入1ml 复苏培养基RM，37℃，200rpm，复苏3h后，涂板。37℃，过夜培养

与转染试剂有关，转不进去可以考虑换其他转染试剂看看

转化大质粒至枯草芽孢杆菌的步骤通常包括以下步骤：准备菌株、菌丝体处理、DNA转化等。如果你发现质粒无法转化到菌种，可能需要考虑以下因素：

1. 菌株的状态：确认菌株是在最佳生长状态，一般是在菌丝体生长阶段，这对于DNA的成功转化是很重要的。

2. 质粒的浓度和纯度：质粒浓度太低或质粒存在杂质都可能影响转化效率。

3. 电转化参数：电转化是一种常用的转化方法，但其参数设置需要准确，电压、电冲击时间、脉冲间隔等都可能影响转化效果。

4. 回复培养：回复培养的条件如温度、时间、液体培养基的成分也会影响转化效率。

5. 筛选条件：选择适当的抗性标记，并确保筛选条件（例如抗性浓度、孵育时间等）是合适的。