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        求助:使用lipo3000向hepg2细胞内转染siRNA失败

        相关实验:细胞转染

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        dxy_j1fimif8

        目前实验做了一个多月了,目的基因一直没有成功敲低过(在mRNA水平,蛋白水平未检测),阳性对照组GAPDH的敲低效率大概在50%左右。下面是具体的步骤(24孔板)

        1.前一天使用无抗生素的完全培养基铺24孔板(细胞用量:一个24孔板大概用1/5-1/4个10cm皿细胞;也计过数每孔铺20-25万个细胞;每孔体积为450ul),第2天转染,在24小时内完成;

        2.A:25ul opti-MEM + 1.5ul lipo 3000;

        B: 25ul opti-MEM + 2.5ul siRNA (siRNA终浓度为100nM).

        室温平衡5分钟,后将B管轻柔加进A管中,混匀室温孵育10-15分钟。

        3.每孔取50ul AB混合液滴入24孔板中,轻晃混匀。

        4.转染6小时后换含有双抗的完全培养基。

        5.qpcr验证敲低效率(转染24小时,36小时都提过)

        目前来看,效果都不理想,阳性对照只能敲低50%左右,目的基因在20-30%,siRNA是在吉满公司定的三保一,阳性对照敲不到70%不售后。请问我上面的步骤哪些地方需要改进啊,还有需要换转染试剂么,换什么比较好啊,救救孩子吧。

        下面是在96孔板内转染cy3-siRNA的明场与荧光图(转染效率大概50-60%?)图片描述图片描述

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        4 个回答

        user-title

        huarenqiang5

        有帮助

        你这个主要考虑是转染时间不够,建议延长转染时间看看。

        user-title

        sswei

        有帮助

        可通过减少细胞密度,延长转染时间,更换转染试剂或培养基等方法,来提高实验效果。

        user-title

        土井挞克树

        有帮助

        转染时间可以相应延长,或者增加一些促染剂

        user-title

        loveliufudan

        有帮助

        根据你提供的实验步骤和结果,我可以提出一些可能需要改进的方面:

        细胞密度:你使用的细胞密度可能需要调整。对于HepG2细胞,推荐的密度是每孔5-8万个细胞。如果使用的细胞太多,可能会影响转染效率。

        转染试剂:你使用的是Lipo3000试剂,可能需要考虑更换其他转染试剂进行比较。例如,使用RNAiMAX试剂或者JetPRIME试剂等。需要注意的是,不同的试剂可能适用于不同的细胞类型,需要根据自己的实验条件进行选择。

        SiRNA的浓度和效价:你使用的是100 nM的SiRNA,如果实验效果不理想,可以尝试调整SiRNA的浓度和效价。可以考虑减少SiRNA的浓度和效价,或者尝试使用其他供应商的SiRNA进行比较。

        转染时间和培养时间:你目前的转染时间是6小时,可以考虑延长转染时间并观察效果。同时,你在转染后24小时和36小时进行了验证,也可以尝试延长培养时间进行观察。

        培养基:你使用的是不含抗生素的完全培养基,需要注意培养基的质量和配制方法,避免对实验结果产生影响。

        总的来说,转染SiRNA的效果受到很多因素的影响,需要根据实验条件进行细致的优化。可以尝试对细胞密度、转染试剂、SiRNA浓度和效价、转染时间和培养时间、培养基等方面进行优化,同时也需要合理设计对照实验来确定问题的原因。

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