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        蛋白在14-17KDa,wb一直曝光不出来,请问是为什么

        相关实验:蛋白质免疫印迹(Western Blot,WB)

        user-title

        dxy_kcup4ug3

        蛋白是新提的,一抗换新了,转膜是200mA,60分钟,没条带,以为转膜转过了,重做后转膜200mA,45分钟,还是没条带,到底为啥

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        3 个回答

        user-title

        balalaLy

        有帮助

        14-17分子量不大,转膜一般没问题,可以从抗体的质量、抗体浓度低、蛋白量低、抗体稀释液、tbst这几个方面找。

        user-title

        sswei

        有帮助

        1.抗体染色不充分 增加抗体浓度,延长孵育时间。

        2.酶活性降低 直接将酶和底物进行混合,如果不显色则说明酶失活了。选择在有效期内、有活性的酶联物。

        3.标本中靶蛋白含量太低 增加标本上样量。

        4.洗膜过度 缩短洗涤时间。

        user-title

        loveliufudan

        有帮助

        这可能有几个原因:

        1. 蛋白提取量太低或蛋白质量差。如果蛋白提取量太低,或蛋白在提取过程中降解, Western blot无法检测到。可以增加蛋白提取量,或优化提取条件改进蛋白质量。

        2. 一抗效价或特异性不够。如果一抗效价较低或与蛋白质有交叉反应,无法检测到特异性条带。应选用特异性更高和效价更高的一抗。

        3. 转膜条件不适宜。转膜电流过高或时间过长会导致蛋白降解或脱离膜;电流过低或时间过短未能将足量蛋白转移到膜上。应适当优化转膜电流和时间。

        4. 二抗问题。如果二抗效价或与一抗的结合能力较差,也无法检测到条带。应选用更适宜的二抗进行检测。

        5. 显色基质质量差。如果显色基质活性或灵敏度较低,无法产生强信号或条带。更换高灵敏度的化学发光显色基质进行检测。

        6. 洗涤条件不当。如果洗涤过于激烈,会冲刷掉转膜上的蛋白或抗体,导致没有条带。应适当减少洗涤次数或使用更温和的洗涤液。

        综上,没有检测到条带的原因比较多,但以蛋白提取与转移、抗体效价与质量及转膜条件为主。建议从这三个方面重新设计和优化实验,应能明显提高实验成功率和条带强度。

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