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        泛素化连接方式

        相关实验:蛋白质泛素化分析

        user-title

        dxy_9lsrt5o9

        已知A蛋白能够被泛素化通过泛素-蛋白酶体途径降解,为了研究其泛素化连接方式是k-48、k-63还是其他连接方式。

        1.查阅文献后发现研究泛素化连接方式都是通过IP确定,为什么不直接通过WB比较未转染泛素蛋白和转染泛素蛋白后蛋白A表达量上的差异确定泛素化连接方式。

        2.抑制剂到底需不需要加,怎么取舍

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        3 个回答

        user-title

        汤姆卜丽波

        有帮助

        一般我们明确泛素化连接方式都需要IP+WB,重复验证这样才更稳妥,单独WB出来的结果可信度不高

        user-title

        loveliufudan

        有帮助

        1. 直接通过WB比较确定泛素化方式有以下局限性:

        (1) WB不能明确区分不同连接方式的泛素化。

        (2) 泛素化不一定导致靶蛋白降解,连接方式不同对蛋白表达量的影响可能不同。

        (3) 需要抑制蛋白酶体活性,否则被泛素化标记的蛋白可能已被降解。

        2. IP确定泛素化方式的优势:

        (1) 可以分离不同连接方式的泛素化蛋白。

        (2) 明确鉴定泛素化部位和类型。

        (3) 不依赖于蛋白降解,直接检测标记状态。

        (4) 结合质谱可以全面解析泛素化形式。

        3. 是否需要加抑制剂:

        (1) 如果只检测表达量变化,必须抑制蛋白酶体,否则已降解的泛素化蛋白无法检测。

        (2) 如果通过IP检测标记状态,可不用抑制剂。但加抑制剂可以积累样本。

        综上,IP配合质谱是确定蛋白泛素化方式的金标准。WB仅评估表达量变化不够确切。抑制剂可选根据实验目的选择是否使用。

        user-title

        huarenqiang5

        有帮助

        泛素含有76个残基,通过羧基端的甘氨酸与靶蛋白赖氨酸的侧链氨基共价结合。泛素之间也可以通过这种方式连接成泛素链。泛素分子中有七个赖氨酸残基,即K6,K11,K27,K29,K33,K48和K63,另外N端的甲硫氨酸也可用于泛素之间的连接,这样就有8种连接方式,各有不同功能。

        K48连接最为常见,约占所有连接的50%。K48链主要用于蛋白酶体降解,K11参与内质网介导的降解途径和细胞周期进程的控制,而K29则调控蛋白质的溶酶体降解。K6泛素链在抑制蛋白酶体后未发生富集,表明其可能具有非降解作用。K6泛素链可能与DNA损伤、线粒体稳态等相关。而K27和K33多泛素化可能与先天免疫和免疫反应有关。

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