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        求教泛素化实验

        相关实验:蛋白质泛素化分析

        user-title

        phyluncle

        预检测细胞中蛋白A的泛素化变化情况,有的文章将细胞中转染干预因素B+HA-Ub质粒(泛素过表达质粒),然后使用MG132处理各组细胞后提总蛋白,然后再向各组蛋白中加入HA-tag抗体做蛋白IP,然后WB检测蛋白A的泛素化情况。问题:

        1.为什么要转染HA-Ub过表达质粒?泛素化实验都需要转染这个质粒吗?

        2.为什么不用蛋白A抗体做IP,然后用泛素抗体做WB检测蛋白A的表达?

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        2 个回答

        user-title

        土井挞克树

        有帮助

        为什么要转染HA-Ub过表达质粒?

        转染质粒是后续做泛素化需要的,必须转染。

        为什么不用WB检测蛋白A的表达?

        可以用,但是不容易成功。

        2023-01-30

        user-title

        loveliufudan

        有帮助

        1.转染HA-Ub过表达质粒的目的是为了增加细胞中Ubiquitin的水平,使其可以更好地配对泛素化蛋白,从而可以提高实验效果。不一定所有的泛素化实验都需要转染HA-Ub过表达质粒,但是如果需要快速检测某个蛋白的泛素化变化情况,那么这种方法是很有效的。

        2.直接用蛋白A抗体做WB并不能很好地证明蛋白A的泛素化情况,因为泛素化蛋白和未泛素化蛋白的外观是一样的。因此,需要先加入HA-tag抗体,证明蛋白A是否已经泛素化,然后再进行WB检测。

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