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        E3 泛素连接酶的活性测定

        相关实验:蛋白质泛素化分析

        最新修订时间:

        简介

        E3 泛素连接酶的活性测定是用于泛素化分析的一种实验方法。细胞内泛素化最重要的调节酶是泛素连接酶 (E3)。 目前已经鉴定出几百种 E3, 绝大多数 E3 有底物特异性 ,但 有的 E3 也可以识别数种底物。

        原理

        E3 泛素连接酶活性测定的基本原理都是检测体外泛素化反应,可 采用两种方式,一种是测定 E3 的自我泛素化, 另一种是用专门的蛋白(例如核酸酶 S 肽)作为泛素化底物来测定目的蛋白(可以 GST 融合蛋白形式表达纯)是否具有 E3 酶活性。

        材料与仪器

        试剂:

        1、5x 泛素化反应缓冲液: 250 mmol/L TrisHCl(pH 7.5), 12.5 mmol/L MgCl2,2.5 mmol/L DTT, 10 mmol/L ATP

        2、 E1 泛素激活酶

        3、 E2 泛素结合酶

        4、 泛素

        5、 2 x SDS-PAGE 上样缓冲液

        步骤

        E3 泛素连接酶的活性测定用于泛素化分析的基本过程可分为如下几步:

        A、在每一反应管内加入:4 微升 5X 泛素化反应缓冲液,1.5 ug 纯化 GST- 融合蛋白(待检测 E3 活性的蛋白质),1.5 ug 核酸酶 S 蛋白(底物),100 ng E1 泛素激活酶,500 ng E2 泛素结合酶,2.5 ug 泛素,H2O 补足体积至 20 ul。对照反应管内可分别去除上述反应的各个成分。

        B、室温反应 1.5 h 以上。

        C、加入 20 ul 2 x SDS-PAGE 上样缓冲液终止反应, 95 °C 5 min。


        D、进行 SDS-PAGE, 转移至 PVDF 膜。

        E、用抗 Ub 抗体进行免疫印迹检测。

        来源:丁香实验

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