WB同一样本，相同上样量，检测同一分子 但条带深浅相反的问题？

可能ecl曝光液在膜上不均匀（将印迹膜泡在曝光液中显影），也可能是点样的时候上样量误差（振荡混匀然后离心加样），

可能是转膜的那个电线锈掉了，导致每一块转的程度不一样。

考虑与转膜有关，可能是转膜时候受力不均导致。

可能存在多种原因导致同一样本上两次 Western blot 的内参蛋白块颜色深浅相反：

蛋白质上样量不均匀：虽然您说上样量相同，但是有可能上样的时候分布不均匀，导致某些位置的上样量比其他位置多或者少，从而影响条带的深浅。

蛋白质迁移不均匀：Western blot 过程中，蛋白质在电场作用下迁移到膜上，如果迁移不均匀，也会导致条带深浅不一。

蛋白质降解或者失活：不同时间采集的样本，蛋白质的降解或者失活情况可能会不同，从而影响内参蛋白的含量和稳定性。

蛋白质的批次和来源不同：如果不同时间点的实验使用的蛋白质批次和来源不同，可能存在差异，也可能影响内参蛋白的表达量和稳定性。

为了解决这个问题，可以尝试规范化实验操作流程，确保上样量和膜上迁移条件的一致性，尽可能减小实验误差。此外，可以使用多个内参蛋白来检测，确保结果的准确性。

这个图片里面靠近中间的条带都比较浅，看看胶有没有问题