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科研学霸天团，48小时有问必答

问乙酰胆碱酯酶保存及母液配置

Dr_劉医生

-20摄氏度避光保存，6个月。

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问用流动相平衡基线时，为啥一直往负值走?

土井挞克树

　①柱温波动。（即使是很小的温度变化都会引起基线的波动。通常影响示差检测器、电导检测器、较低灵敏度的紫外检测器或其它光电类检测器。）　　②流动相不均匀。（流动相条件变化引起的基线漂移大于温度导致的漂移。）　　③流通池被污染或有气体　　④检测器出口阻塞。（高压造成流通池窗口破裂，产生噪音基线）　　⑤流动相配比不当或流速变化　　⑥柱平衡慢，特别是流动相发生变化时　　⑦流动相污染、变质或由低品质溶剂配成

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问请问跑一次western每个样品上样的蛋白量大概在多少mg范围内呀？

土井挞克树

如果是单一条带的样品10微克的上样量就足够了,如果是细胞裂解液这样的样品可以提高一些上样量30~80微克的样子.

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问elisa多个板上的数据可以一起比较吗

huarenqiang5

在测定不同板中的样品时，每一个板都对应一条标准曲线。技术错误或者不同的孵育情况，环境条件都会引起酶标板之间产生不同结果。一条标准曲线测定的样品值必需是在相同环境下产生的，否则就是无效值。

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问高效液相色谱跑样一直没出峰是为什么，程序还没跑完可以提前停止，或者能直接改变流动相比例吗

此用户已注销

可以，一般有终止运行或中断运行，停止采集等按钮或选项。但是停止后就无法继续进行数据采集，之后的图谱自然不能进入数据中。需要注意的是如果在停止前仍有色谱峰没有走完，而你在停止后立即进样采集下一针，会导致前一针的峰出在后一针的色谱图中。

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问WB实验上层胶怎样避免有气泡呢？

huarenqiang5

1）玻璃板一定要洗干净，用洗洁净洗，冲干净后再用双蒸水冲一，晾干。配胶的时候沿管壁缓缓加入各个成分，混匀的时候用手轻轻摇匀，如果用枪吹打时要缓慢且不要打到头。2）配胶时混匀要轻，尽量不产生气泡，上胶时要快，枪也不打到底。加完分离胶后用双蒸水封，待其凝固。即使在上胶时液面上有气泡，加水后也会浮上来。分离胶凝好后，倒掉里面的水，用吸水纸吸干，再加浓缩胶，迅速插梳子。3）倒胶的时候，用1ml的枪沿一侧缓

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问3t3-l1.细胞诱导成功嘛……

huarenqiang5

你这个细胞诱导是应该已经成功了。

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问PMA诱导THP1极化

土井挞克树

pma无法完全去掉，只能多冲洗减小影响。多用pbs冲洗

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问脱硫生物素标记蛋白质的操作方法？

土井挞克树

脱硫生物素标记蛋白质的操作方法工具/原料• 10ul，50ul，200ul，1000ul可调高精度移液器• 恒温箱（37℃）• 离心机（离心力可达到12,000×g）• 生物素标记试剂盒实验前准备仔细阅读使用说明书。2.计算待使用NH2-Reactive Biotin的量。3.提前20min从冰箱中取出试剂盒，平衡至室温（注：不需要用到的NH2-Reactive Biotin继续放置冰箱中）。4.

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问求问WB一抗可以敷多久？

申东熙老伯

放在4℃孵育的可能还能用，解封出来多洗一洗，二抗敷久一点看看。

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问做NF-KB通路一般都检测哪些蛋白

土井挞克树

这个通路包含一个家族的蛋白，还有反应复合体。可以参考下表

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问如何用更简便地方法构建荧光蛋白菌株呢

Dr_劉医生

先去数据库找到目的的荧光蛋白，然后将荧光蛋白的基因序列构建到细菌质粒和病毒载体中，最后转入细胞体内。

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问酶学性质考察粗酶液的比活力为1.84U/mg蛋白纯酶液的比活力为1.885U/mg蛋白

Dr_劉医生

需要用纯酶再做一遍酶学性质，二者活力相当只能说明后续反应可能一样，但粗酶液有杂质和化合物的存在，会影响检测结果。

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问实验小白，想请问一下细胞分泌的炎症因子，本质上也为蛋白，可以用来跑WB吗？为什么一般都用Elisa 检测的细胞上清液中的炎症因子

Dr_劉医生

本质原理上elisa和WB都可以，但炎症因子作为蛋白质，存在浓度级的问题，太低了根本检测不到，或者不能真实反映；首先，ELISA抗原抗体都能检测，而WB主要检测的就是抗原。对于ELISA主要的特点就是，使用的抗原或抗体是与某种酶连接成的酶标抗原或抗体，由于酶的催化效率很高，可以放大反应效果，增大检测的灵敏度，因此ELISA的检测限可以达到ng级，但WB显色敏感度一般在pg级。

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问免疫共沉淀实验可以确定蛋白之间的结合是直接还是间接的吗？

Dr_劉医生

不可以的，GST pull down实验才能明确直接还是间接。免疫共沉淀主要是通过目的蛋白抗体共沉淀下来的是一个蛋白复合物，而不仅仅是和目的蛋白直接相互作用的蛋白。而GST-Pull down实验可以通过体外实验条件，去除其它蛋白的影响，从而确定目的蛋白和待检测蛋白是否可以发生直接相互作用。

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问Western内参不齐

juyue2010

可能原因：蛋白定量是否准确，上样前是否混匀

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问多聚赖氨酸处理的玻片能反复用吗

Dr_劉医生

可以反复用，做好玻片处理就行：玻片处理：1.灭菌水稀释聚赖氨酸溶液，一般的使用浓度为0.01％。2.将玻片浸在稀释的多聚赖氨酸溶液5分钟。注意增加时间不会提高包被效果。3.在60℃烘箱1小时干燥，或室温18-26℃过夜干燥待用。

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问RAW264.7用RANKL诱导破骨细胞的问题

Dr_劉医生

普遍现象，总结经验和文献后可能原因有2个：一是选择RANKL最好是对应RAW细胞株的，鼠源还是人源。二是RANKLE浓度一般是50ng/ml，而且是自身浓度，不是培养基稀释后的浓度。

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问co—ip两个分子距离很近

balalaLy

1、可以先孵一个stripping后孵第二个，2、一般都是要求正反拉

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问为什么Ｗｂ蛋白样品，上样前需要煮？

huarenqiang5

只有煮沸，才能消除蛋白质的立体二级结构，伸展为一维线性结构，所以一般来讲二聚体都会解体，才能完全按照分子量跑电泳，加的蛋白Marker才有指示分子量的意义！二硫苏糖醇或巯基乙醇可以破坏二硫键，煮加速蛋白质的变性，SDS的存在可以使每个氨基酸带相同的电荷，使整个蛋白呈线性结构。100度煮10min后13000，离心5分钟，取上清电泳，因为沉淀会导致拖尾。也可以取上清到另一管，4度可以放一周备再次电泳

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