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新手小白真的不知道为啥,自己跑出来的蛋白就是啥也看不清楚
NatureBios
内参过曝了,目的蛋白背景高,封闭和抗体稀释液换一下做个对比,选个更合适的,根据内参辅助调整上样量,浓缩胶可以多一些,
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问
有什么方便快捷测反相色谱柱柱效的方法,测柱效进样之前也要冲柱子平基线吗
dxyc42u
测柱效进样之前我们一般是要冲柱子平基线
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问
WB内参不齐,请各位大佬指点,内参不齐具体原因,谢谢大家!
土井挞克树
内参不齐可能是一抗的孵育时间过长或者特异度不够,可以重新孵育
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乙酰胆碱酯酶保存及母液配置
Dr_劉医生
-20摄氏度避光保存,6个月。
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问
用流动相平衡基线时,为啥一直往负值走?
土井挞克树
①柱温波动。(即使是很小的温度变化都会引起基线的波动。通常影响示差检测器、电导检测器、较低灵敏度的紫外检测器或其它光电类检测器。) ②流动相不均匀。(流动相条件变化引起的基线漂移大于温度导致的漂移。) ③流通池被污染或有气体 ④检测器出口阻塞。(高压造成流通池窗口破裂,产生噪音基线) ⑤流动相配比不当或流速变化 ⑥柱平衡慢,特别是流动相发生变化时 ⑦流动相污染、变质或由低品质溶剂配成
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问
请问跑一次western每个样品上样的蛋白量大概在多少mg范围内呀?
土井挞克树
如果是单一条带的样品10微克的上样量就足够了,如果是细胞裂解液这样的样品可以提高一些上样量30~80微克的样子.
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问
elisa多个板上的数据可以一起比较吗
huarenqiang5
在测定不同板中的样品时,每一个板都对应一条标准曲线。技术错误或者不同的孵育情况, 环境条件都会引起酶标板之间产生不同结果。一条标准曲线测定的样品值必需是在相同环境 下产生的,否则就是无效值。
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问
高效液相色谱跑样一直没出峰是为什么,程序还没跑完可以提前停止,或者能直接改变流动相比例吗
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可以,一般有终止运行或中断运行,停止采集等按钮或选项。但是停止后就无法继续进行数据采集,之后的图谱自然不能进入数据中。需要注意的是如果在停止前仍有色谱峰没有走完,而你在停止后立即进样采集下一针,会导致前一针的峰出在后一针的色谱图中。
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问
WB实验上层胶怎样避免有气泡呢?
huarenqiang5
1)玻璃板一定要洗干净,用洗洁净洗,冲干净后再用双蒸水冲一,晾干。配胶的时候沿管壁缓缓加入各个成分,混匀的时候用手轻轻摇匀,如果用枪吹打时要缓慢且不要打到头。2)配胶时混匀要轻,尽量不产生气泡,上胶时要快,枪也不打到底。加完分离胶后用双蒸水封,待其凝固。即使在上胶时液面上有气泡,加水后也会浮上来。分离胶凝好后,倒掉里面的水,用吸水纸吸干,再加浓缩胶,迅速插梳子。3)倒胶的时候,用1ml的枪沿一侧缓
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问
3t3-l1.细胞诱导成功嘛……
huarenqiang5
你这个细胞诱导是应该已经成功了。
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问
PMA诱导THP1极化
土井挞克树
pma无法完全去掉,只能多冲洗减小影响。多用pbs冲洗
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问
脱硫生物素标记蛋白质的操作方法?
土井挞克树
脱硫生物素标记蛋白质的操作方法工具/原料• 10ul,50ul,200ul,1000ul可调高精度移液器• 恒温箱(37℃)• 离心机(离心力可达到12,000×g)• 生物素标记试剂盒实验前准备仔细阅读使用说明书。2.计算待使用NH2-Reactive Biotin的量。3.提前20min从冰箱中取出试剂盒,平衡至室温(注:不需要用到的NH2-Reactive Biotin继续放置冰箱中)。4.
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问
求问WB一抗可以敷多久?
申东熙老伯
放在4℃孵育的可能还能用,解封出来多洗一洗,二抗敷久一点看看。
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问
做NF-KB通路一般都检测哪些蛋白
土井挞克树
这个通路包含一个家族的蛋白,还有反应复合体。可以参考下表
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如何用更简便地方法构建荧光蛋白菌株呢
Dr_劉医生
先去数据库找到目的的荧光蛋白,然后将荧光蛋白的基因序列构建到细菌质粒和病毒载体中,最后转入细胞体内。
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酶学性质考察 粗酶液的比活力为1.84U/mg蛋白 纯酶液的比活力为1.885U/mg蛋白
Dr_劉医生
需要用纯酶再做一遍酶学性质,二者活力相当只能说明后续反应可能一样,但粗酶液有杂质和化合物的存在,会影响检测结果。
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实验小白,想请问一下细胞分泌的炎症因子,本质上也为蛋白,可以用来跑WB吗?为什么一般都用Elisa 检测的细胞上清液中的炎症因子
Dr_劉医生
本质原理上elisa和WB都可以,但炎症因子作为蛋白质,存在浓度级的问题,太低了根本检测不到,或者不能真实反映;首先,ELISA抗原抗体都能检测,而WB主要检测的就是抗原。对于ELISA主要的特点就是,使用的抗原或抗体是与某种酶连接成的酶标抗原或抗体,由于酶的催化效率很高,可以放大反应效果,增大检测的灵敏度,因此ELISA的检测限可以达到ng级,但WB显色敏感度一般在pg级。
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免疫共沉淀实验可以确定蛋白之间的结合是直接还是间接的吗?
Dr_劉医生
不可以的,GST pull down实验才能明确直接还是间接。免疫共沉淀主要是通过目的蛋白抗体共沉淀下来的是一个蛋白复合物,而不仅仅是和目的蛋白直接相互作用的蛋白。而GST-Pull down实验可以通过体外实验条件,去除其它蛋白的影响,从而确定目的蛋白和待检测蛋白是否可以发生直接相互作用。
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Western内参不齐
juyue2010
可能原因:蛋白定量是否准确,上样前是否混匀
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问
多聚赖氨酸处理的玻片能反复用吗
Dr_劉医生
可以反复用,做好玻片处理就行:玻片处理:1.灭菌水稀释聚赖氨酸溶液,一般的使用浓度为0.01%。2.将玻片浸在稀释的多聚赖氨酸溶液5分钟。注意增加时间不会提高包被效果。3.在60℃烘箱1小时干燥,或室温18-26℃过夜干燥待用。
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