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科研学霸天团，48小时有问必答

问蛋白纯化实验前需要先做好哪些准备？

dxy_gwrp7ndq

对于微生物，应注意它的生长期，在微生物的对数生长期，酶和核酸的含量较高，可以获得高产量，以微生物为材料时有两种情况：（1）得用微生物菌体分泌到培养基中的代谢产物和胞外酶等；（2）利用菌体含有的生化物质，如蛋白质、核酸和胞内酶等。植物材料必须经过去壳，脱脂并注意植物品种和生长发育状况不同，其中所含生物大分子的量变化很大，另外与季节性关系密切。对动物组织，必须选择有效成份含量丰富的脏器组织为原材料

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问用于纯化的亲和层析填料形式有哪些？他们各自的优缺点是什么？

dxy_gwrp7ndq

分类及其优缺点：生物亲和层析生物亲和层析是利用自然界中存在的生物特异性相互作用物质对的亲和层析。通常具有高的选择性。典型的物质对有酶﹣底物、酶﹣抑制剂、激素﹣受体等。免疫亲和层析利用抗原抗体中的一方为配体，亲和吸附另一方的分离系统，称免疫亲和层析。免疫亲和层析应用相当广泛。此种方法的纯化蛋白倍数活性回收率非常高。用免疫层析柱进行各种类型的免疫检测被称为免疫检测法，特别适用于检测含量低微的样品。免疫

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问膜分离技术在蛋白质的分离纯化方面具有哪些优势和不足？

lyang556

优点1、能耗低。膜分离不涉及相变，对能量要求低，与蒸馏、结晶和蒸发相比有较大的差异。2、分离条件温和，对于热敏感物质的分离很重要。3、操作方便，结构紧凑、维修成本低、易于自动化。缺点1、膜面易发生污染，致使膜分离性能降低，故需采用与工艺相适应的膜面清洗方法。2、稳定性、耐药性、耐热性、耐溶剂能力有限，故使用范围有限。3、单独的膜分离技术功能有限，需与其他分离技术连用。

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问MTT实验时怎样避免血清干扰的问题？

bamboopiggy

血清不会影响mtt的结果啊，因为你加完mtt以后，要吸出，然后加dmso溶解甲臢，不存在血清影响的问题。如果你用cck8也没事，会对cck8造成影响的是氧化剂，不是血清。

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问等电聚焦电泳实验中发现背景过高，可采取的策略是？

迟C迟

控制以下几项：槽液的PH、电导率、固体份、颜基比、温度，电泳时电压。检查试剂是否正确、是否过期，最好重新配电泳液、缓冲液这些。

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问怎样有效减少His标签蛋白纯化效果不理想的问题？

迟C迟

1、His标签在中性或碱性条件（pH7~8）下，与Ni2+有更强的结合力，与Tris-HCl缓冲液相比，在磷酸缓冲液中His标签表现出与Ni2+更强的结合力。2、HisTrap HP和HisTrap FF的蛋白结合载量都是至少40mg (His) 6重组蛋白。大家可以根据填料的结合载量选择预装柱和填料的规格。3、如果目标蛋白中的咪唑需要去除，可以根据样品体积选择适合的上机脱盐柱（HiTrap De

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问凝胶过滤层析过程中发现分辨率不高的常见原因有哪些？

府宅

1.加样要尽量快速、均匀。另外加样量对实验结果也可能造成较大的影响，加样过多，会造成洗脱峰的重叠，影响分离效果；加样过少，提纯后各组分量少、浓度较低，实验效率低。加样量的多少要根据具体的实验要求而定：凝胶柱较大，当然加样量就可以较大；样品中各组分分子量差异较大，加样量也可以较大；一般分级分离时加样体积约为凝胶柱床体积的1％－5％左右，而分组分离时加样体积可以较大，一般约为凝胶柱床体积的10％－25

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问对含量少又不稳定的活性生物分子更为有效的分析方法是什么？

dxywode

吸附柱层析吸附柱层析是以固体吸附剂为固定相，以有机溶剂或缓冲液为流动相构成柱的一种层析方法。

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问Strep tag(strep标签)有哪些特点？

天一湖医者

1.适合从真核或原核表达体系中纯化strep 标签蛋白2. Strep-Tag II 为8 个氨基酸（W-S-H-P-Q-F-E-K），不会影响标签蛋白的功能结构。3. Strep-tag 可以和His 标签蛋白联合使用，进行两步纯化获得超高纯度蛋白。

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问Rt-pcr怎么样提高cDNA 的合成产量？

府宅

1.PCR反应体系的组成，如酶离子的浓度等也会显著影响；2.PCR条件，如引物的退火温度选择对提高PCR试验的灵敏度和产量也非常关键；3.如果PCR产量较低的话，你也可以通过二次PCR来提高产量，即把第一次的PCR产物适当稀释，再以它作为模班进行PCR，同时你也可以通过TOUCH-DOWN PCR来提高PCR的特异性和产量。

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问蛋白纯化常用的标签有哪些？

dxy_gwrp7ndq

常用的标签有His标签、GST标签、Strep II标签、MBP标签、Flag标签、 Myc标签、SUMO标签、组合式的双标签

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问使用随机引物是否对样品质量要求更高？在提的时候有没有需要特别注意的？

dxywode

使用随机引物，即使使用的质粒DNA模板微量也能够进行反应，其在反应时对模板没有较为严格的要求。注意事项1.模板DNA应当为线性的。2.需要认真调整引物与模板的比例，如果引物比模板高，那么会得到较短片段的探针，然而累积较多的产物；相反，则反应产物比较长。

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问Rt 的引物Oligo dt、随机引物、基因特异性引物，这三种有什么区别呢？哪种比较好呢？

bamboopiggy

一般情况下。反转录的kit里面带的引物就是oligo dt和随机引物的混合物，直接用就可以，除非你是想从其中调出你的特异性基因，然后得到cdna，做过表达，否则。不需要用特异性引物，否则翻转效率会很低。

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问目标蛋白设三个孔，目标蛋白跑的都不齐，内参是齐的

未来9

可能是由于凝胶的中间部分凝固不均匀所致，多出现于较厚的凝胶。处理办法：配胶时一定要充分混匀，待其充分凝固后再做后续试验

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问电泳实验怎么分析条带?

whilt-shirt

主要是用Image J分析灰度值，将目的条带与内参的灰度值相比，就可以得到你目的蛋白的相对表达量

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问做wb实验每次只加一种一抗，可以同时加两种或者多种一抗的吗？

邓豆豆逗

理论上可以的，但需要把握好每种抗体的稀释比，否则很容易因为某个抗体效果太好或者某个蛋白表达量很高而只能看到一个条带，而且抗体尽量选单抗，不然杂带太多也会影响其他抗体效果

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问如果没有注明可以用来做Western blot的一抗，可以用于Western blot实验吗？

邓豆豆逗

可以尝试做一下，如果做出来条带位置正确的话就是可以用于wb，一般抗体官网标明的适用实验是他自己验证过的，其他没写的不是说不能用，而是他没有验证，望采纳

7 回答603 围观

问蛋白质电泳图谱精度怎么控制？

wuli猫宁

根据聚丙烯酰胺凝胶薄片上蛋白质电泳带的粗细、深浅和迁移率，绘制电泳图谱，并计算相似率。

3 回答299 围观

问在实验中无蛋白质的区域具有高背景是什么原因？要从哪些方面改进？

迟C迟

高背景可能是因为封闭不好：蛋白质转印到PVDF 膜或 NC 膜后，泳道与泳道间的空隙没有蛋白质；这时我们需要藉由额外的蛋白质缓冲液来填补其空白处。由于抗体本身也是一种蛋白质，因此若封闭作用不足，抗体可能会填进空白处的位置，进而造成高背景的结果。解决方案： a.封闭作用不足：这是其中一种可能的原因，提高封闭物浓度可确保封闭液完全复盖转印膜，如使用5% 脱脂奶粉或BSA。 b.封闭液是否会与抗体反应：

3 回答402 围观

问如何通过DNAstar测序已知序列

whilt-shirt

1、打开NCBI，搜索基因2、找到该序列的CDS序列，输入到序列的标准格式的文件中点击CDS序列，复制该序列即可，输入到标准的SEQ格式中3、打开DNASTAR软件，File-Enter Sequence，选择需要比对的序列，Done即可4、点击Align中的By clustal W method

2 回答684 围观

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