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科研学霸天团，48小时有问必答

问CO-IP实验如何确定蛋白相互作用是发生在细胞中的，而不是由于细胞破裂溶解释放蛋白产生了互作？

lyang556

细胞裂解时采用温和的裂解条件，应采用非离子变性剂（如：NP40），这样能够不破坏细胞内存在的所有蛋白质－蛋白质相互作用。要想明确蛋白间的相互作用是细胞中发生还是细胞的溶解才发生需要进行蛋白质定位。

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问第一次做CO-IP实验，有什么注意事项？请做过的大佬们提提经验避避雷

lyang556

首先明确实验目的，确定抗体和需要捕获蛋白。然后注意研究实验步骤，可以参阅别人的实验经验，少走弯路。选择合适的试剂，操作时要认真，尤其是样本制备和Pre-clearing过程。

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问wb实验怎么选择抗体，设计实验能省一点钱呢？

bamboopiggy

1.做预实验。2.尽可能的把蛋白条带的size错开。如果就几条带，可以把胶切小了，减少膜的用量。尽量切膜，加抗体，不要加全膜，除非实验必须。3.找公司申请抗体的试用装，或者找别的实验借。

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问我现在手头有个融合蛋白，纯化的时候用助溶剂溶解后做了GST亲和层析，之后用蛋白酶切割后却发现目的蛋白没有活性。什么原因怎么解决

lyang556

估计是你的蛋白失活了，应该注意下实验步骤，看看提取、纯化、酶切具体是哪一步操作不当导致的，搞清楚后重做试试！

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问westerblot条带弯曲怎么办

bamboopiggy

胶配的时候，注意混匀。低电压，延长跑胶时间，跑胶的时候注意降温。

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问电极法测电解质中直接法与间接法的区别？

dxyv9281

1、ISE的直接法和间接法的区别在于直接法未作稀释直接测定,间接法预先稀释后测定,但是两种方法测定的都是离子活度.2、比较ISE法与火焰光度法之间是存在偏差的，ISE法偏高，造成这种差异的原因是：火焰法测定的是血浆中的钠、钾浓度；而电极法测定的是血浆或是血清水中的钠、钾浓度。电极法摒弃了样品中蛋白质和脂类等大分子所占体积，也就是称为基质效应，导致了电极法的结果偏离。对于ISE法中的直接法与间接

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问实验条带为什么会出现断带或者比较特殊的条带?

bamboopiggy

最大的原因可能是转膜的时候没转好，有气泡，或者胶因为太热而变形了或者胶破了。当然也有可能是加抗体的时候，没把膜全部浸泡。或者running buffer有问题，胶配的不匀。

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问新买的蛋白溶解液一般用什么DD水吗

小布丁瑶瑶

还是用灭菌的ddH2O好些。用TE后续试验不方便，同时，EDTA会螯合Mg2+，对后续PCR扩增不好！

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问蛋白跑胶比较淡，考虑蛋白浓度稀释，怎么浓缩蛋白

lyang556

常用的是透析浓缩，可以用透析袋。将要浓缩的蛋白溶液放入透析袋结扎，把高分子聚合物如聚乙二醇（碳蜡）、聚乙烯吡咯、烷酮等或蔗糖撒在透析袋外即可。也可将装有蛋白液的透析袋放入配好的30％－40％浓度的吸水剂中。

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问同一个蛋白（带his-tag），分别用his和其特异性抗体去免疫，WB结果，his的正常，另外一个什么也没有（同一个人同时进行）

dxywode

WB或者anti-his的抗体检查His是否表达；从上游构建入手，改变His-tag的位置（C-terminal or N-terminal），必要时增加His个数（常用6-10个）

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问western提取出来的蛋白质保存方法？

府宅

蛋白样品放到-80℃也并不完全保险，虽然能存放久一些，但是最好不要冻融超过两次。蛋白浓度测定后，可以加入loading buffer 煮样，煮后可根据实验需要分装成小管，下次实验前拿出小管再次煮样即可。

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问提高电泳分辨率的途径有哪些？

bqejjh123

聚丙烯酰胺的充分聚合，可提高电泳的分辨率。

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问westernblot加样的顺序是什么？

dxy_gwrp7ndq

上样顺序一般是让与抗体有反应的样品和没有反应的样品间隔开，这样条带之间反差比较明显。

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问蛋白质变性的温度点是多少度？

司马青山落

蛋白质变性的温度点通常在60℃左右开始。当蛋白质所处的环境温度升高到60℃或以上时，蛋白质的结构会发生变化，这可能导致蛋白质失去其原有的生物活性。

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问WB中内参的意义是什么？

dxy_gwrp7ndq

1. 是看提取蛋白质量的好坏。如果做western的时候，内参照蛋白有条带，而目的蛋白没有，说明蛋白的提取和转膜等步骤没有问题，是目的蛋白的抗体质量不好或者是稀释倍数不对。2. 是比较客观的说明目的蛋白的表达情况，消除上样量等的误差。不同的标本之间由于蛋白提取的量有差别，可能强阳性的表达跑出来的带很弱。因此设立内参照，比较不同标本之间的表达情况。

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问引物设计特异性好，但跑胶有隐约杂带是为什么呢

府宅

1.外源DNA污染，确保操作的洁净；2.Mg2+浓度偏高，因适当调整Mg2+使用浓度；3.若为PCR试剂盒，也可能时试剂盒本身质量有问题。

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问WB中BCA法标准曲线怎么做？

邓豆豆逗

找一个已知准确浓度的蛋白（一般试剂盒的话里面是有的），自己也可以用bsa配，然后稀释一个浓度梯度，比如2，1.5，1，0.8，0.6，0.4，0.2，0.1，0ug/ul，然后每个样至少三个复孔，做出来的od值和浓度做一个散点图，添加趋势线得到公式，然后再将样本的od值带入公式求得浓度就行了

3 回答1227 围观

问跑western blot的时候同一个抗体同一个细胞系或者组织，出现条带数不一致的原因

dxywode

条带位置异常可能是蛋白出现聚体或被修饰，蛋白出现降解有关。

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问如何选择凝胶，以及层析柱？

bqejjh123

层析柱的选择一般根据分离样品的种类而定。纯化蛋白质时，柱床体积应为样品体积的 25～100 倍；而除盐或除游离荧光素时，柱床体积约为样品体积的 4～10 倍。层析柱太短会影响分离效果，如太长会延长分离时间和过度稀释样品。层析柱的内径过细会发生「器壁效应」。层析柱的内径和高度有一定的比例，除盐柱应为 1:5～1:25，纯化蛋白质柱应为 1:20～1:100。

4 回答2836 围观

问骨组织wb内参不齐怎么整？

dxy_gwrp7ndq

不齐可以进行定量分析，然后用目的蛋白除以内参。定量用image plus6

4 回答897 围观

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