实验问答22,786,780 科研人在看

科研学霸天团，48小时有问必答

问要做乳酸菌膜蛋白差异分析，可是用了贝博的膜蛋白提取试剂盒感觉效果不好，问一下提膜蛋白的师兄师姐们，有没有好的提取膜蛋白的方法，谢

bamboopiggy

根据你的实验目的，你选一个要用的试剂盒吧，虽然我不能提公司的名字（要不就说我打广告），但是你应该可以搜到。对于这些比较细的实验，建议不要买国产的试剂盒，虽然便宜，但是做不出好结果。

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问糖蛋白都有哪些呀？有没有纯糖蛋白

bamboopiggy

糖蛋白是一种含有寡糖链的蛋白质，两者之间以共价键相连。其中的寡糖链通常是经由共转译修饰或是后转译修饰过程中的糖基化作用而连结在蛋白质上。糖蛋白多肽链常携带许多短的杂糖链。它们通常包括N-乙酰己糠胺和己糖（常是半乳糖或甘露糖，而葡萄糖较少）。我感觉你可能没有理解你导师的一声，最好去和你导师double check一下，你导师可能想让你表达一个蛋白，但是有糖基化修饰

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问请问这是什么原因造成的呀，好多杂带

天一湖医者

1）目的蛋白有多个修饰位点，本身可以呈现多条带，建议查阅文献或进行生物信息学分析，获得蛋白序列的修饰位点信息，通过去修饰确定蛋白实际大小2) 样本处理过程中目的蛋白发生降解,建议加入蛋白酶抑制剂；样本处理时在冰上操作3）杂蛋白多，建议处理目的蛋白4）抗体特异性不强，建议使用特异性强的抗体5）抗体孵育时间过久，建议减少抗体孵育时间6）二抗与抗原有交叉反应，建议选择合适的封闭物7）二聚体或多聚体存在，

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问wb实验制胶为什么老有气泡呢？如图气泡感觉是在胶和玻璃板之间（板子认真洗干净并且烘干了，图片脏是板子后边的架子）请各位帮帮忙。

bamboopiggy

如果确定玻璃板洗干净了，那就是玻璃板不平，你别用这块了，换一块。

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问蛋白跑成这样咋办，断断续续的，该怎么解决

bamboopiggy

不是跑胶的问题，是你转膜的三明治夹心没有弄好，有的地方转的不匀

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问WB电泳条带弥散不清

bamboopiggy

这个明显是你蛋白浓度高了，你减少一下上样量，20-25ug就够了，不用上太多。太多了，到下面，就压不平了

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问细胞活性氧试剂盒荧光检测

迟C迟

看你的实验步骤没什么问题，应该就是细胞活性氧试剂盒检测的问题，建议换试剂盒。

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问为啥我做的胶有这个东西，是玻璃漏胶吗？

Miracle星

1）每次电泳完后，洗净玻璃、胶条和其它附件，下次用之前，用75％酒精擦拭玻璃和胶条，能有效防漏，且利于剥胶。 2）避免玻璃边缘（与胶条接触处）破损很重要，尤其是下面和胶条接触的地方 3）关键是找一块很平的桌面，使两块玻璃底面非常齐就行了 4）胶条一定要干，跑完电泳后，胶条就放在实验台上晾着。 5）下面的胶条注意不要老化，如果有裂纹的话用保鲜膜垫在上面，也可以有效防止漏胶，或者反过来用。 6）玻璃在

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问半干转显示 no detected 是什么原因？

天一湖医者

检测金属丝，是不是洗的时候断了？联系厂家工程师咨询是最专业且最快的方式。

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问WB做的表面蛋白，总是有两条条带

Miracle星

估计跟常温放置有关系，要是多余的那个条带比你的目的蛋白条带小的话，那么可能就是目的蛋白降解了，你可以重新电转再杂交试试。电转后的膜最好要4℃保存。而且，你也可以查查目的蛋白的相关资料，看这个蛋白是不是有不同的多聚体形式，也有可能是这种情况导致的。

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问WB跑完用丽春红染色什么都没有？

喵喵喵柏

你在跑之前有没有定量测浓度呢？跑的时候看到了溴酚蓝的颜色不代表真的有蛋白

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问做蛋白与蛋白免疫共沉淀时，前提必须得是使用高表达目的蛋白和诱饵蛋白的细胞株嘛？

Miracle星

免疫共沉淀既可以用于检验已知的两个蛋白质在体内的相互作用，也可以找出未知的蛋白质相互作用，不管是两者的哪个，其原则都是一样的，都需要用特异性的抗体与其中的一种蛋白质结合，之后通过蛋白质A或蛋白质G-琼脂糖微珠将复合物沉淀下来，然后用SDS-PAGE鉴定。免疫共沉淀中设置正确的对照非常重要，因为该方法可能出现假阳性的概率比较高，设置的对照包括：在对照组中使用对照抗体，以缺失目的蛋白的细胞系作为阴性

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问为什么用超滤膜包过滤出来的样品浑浊

天一湖医者

过滤后滤液仍然浑浊的原因1.滤纸破裂(1)玻璃棒下端紧靠在一层滤纸处，滤纸被戳破。(2)盛混合物的烧杯没有紧靠玻璃棒，滤纸被混合物冲破。2.混合物没有经过滤纸(1)液面高于滤纸边缘，混合物直接从滤纸和漏斗的间隙直接流下。(2)仪器不干净：漏斗下端不干净;下面收集滤液的烧杯不干净。

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问为什么用考马斯亮蓝法，空白值比样品吸光度值高

天一湖医者

出现这个情况可能是你的样品中的蛋白质含量确实很低，低过一定浓度时，结果就没有参考价值了。也有可能是考蓝工作液存放时间太久失效了，可以用一些蛋白标准品（比如BSA）来检验一下考蓝工作液是否正常。如果要用缓冲液做空白组的话，就用和蛋白样品一样的缓冲液就可以了

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问为啥我36kd出来的不好，而15kd出来的就好很多呢

bamboopiggy

不同的抗体，杂出来的条带形状会不一样，可能你15kd的抗体好

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问电源时有时溴酚蓝晕染特别厉害，都快超过1cm了，有时却很细，这是为什么？成分没换过。

Miracle星

我觉得是不均匀,重新配一下,换下缓冲液电泳缓冲液的问题：因为我以前跑双向的时候也遇到过此现象，后来换用新鲜的电泳缓冲液后溴酚兰就跑得成一条细细的直线了，原理不太清楚。2、分离胶内浓度不均：灌胶的时候胶要混匀，否则胶内浓度不均也会有此现象。3、分离胶凝固不均一：如玻板没洗干净，玻板在灌胶前用吹风吹干时没冷却至室温就灌胶，造成玻板内外温差等。不知正确与否，请大家多讨论。

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问为什么我跑出来的蛋白很圆?

天一湖医者

可能上样量没点好，PAGE胶凝的时间短。

2 回答357 围观

问跑wb,目的蛋白是p-p65，为何40附近的那条带明显

天一湖医者

原因：一抗非特异性与蛋白结合。解决办法：更换一抗。

2 回答807 围观

问非细胞提取物做wb如何选取内参

天一湖医者

样本的种属来源不同，内参的选择也是不一样的。哺乳动物的样本需要选择哺乳动物中稳定表达的蛋白作为内参；同样的，植物样本需要选择植物中稳定表达的蛋白做内参；

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问WB实验中，电转时出现条带弥散是怎么回事？

天一湖医者

可能是电场不均匀，尝试换转膜设备和缓冲液。

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