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科研学霸天团，48小时有问必答

问wb实验制胶为什么老有气泡呢？如图气泡感觉是在胶和玻璃板之间（板子认真洗干净并且烘干了，图片脏是板子后边的架子）请各位帮帮忙。

bamboopiggy

如果确定玻璃板洗干净了，那就是玻璃板不平，你别用这块了，换一块。

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问蛋白跑成这样咋办，断断续续的，该怎么解决

bamboopiggy

不是跑胶的问题，是你转膜的三明治夹心没有弄好，有的地方转的不匀

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问WB电泳条带弥散不清

bamboopiggy

这个明显是你蛋白浓度高了，你减少一下上样量，20-25ug就够了，不用上太多。太多了，到下面，就压不平了

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问细胞活性氧试剂盒荧光检测

迟C迟

看你的实验步骤没什么问题，应该就是细胞活性氧试剂盒检测的问题，建议换试剂盒。

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问为啥我做的胶有这个东西，是玻璃漏胶吗？

Miracle星

1）每次电泳完后，洗净玻璃、胶条和其它附件，下次用之前，用75％酒精擦拭玻璃和胶条，能有效防漏，且利于剥胶。 2）避免玻璃边缘（与胶条接触处）破损很重要，尤其是下面和胶条接触的地方 3）关键是找一块很平的桌面，使两块玻璃底面非常齐就行了 4）胶条一定要干，跑完电泳后，胶条就放在实验台上晾着。 5）下面的胶条注意不要老化，如果有裂纹的话用保鲜膜垫在上面，也可以有效防止漏胶，或者反过来用。 6）玻璃在

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问半干转显示 no detected 是什么原因？

天一湖医者

检测金属丝，是不是洗的时候断了？联系厂家工程师咨询是最专业且最快的方式。

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问WB做的表面蛋白，总是有两条条带

Miracle星

估计跟常温放置有关系，要是多余的那个条带比你的目的蛋白条带小的话，那么可能就是目的蛋白降解了，你可以重新电转再杂交试试。电转后的膜最好要4℃保存。而且，你也可以查查目的蛋白的相关资料，看这个蛋白是不是有不同的多聚体形式，也有可能是这种情况导致的。

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问WB跑完用丽春红染色什么都没有？

喵喵喵柏

你在跑之前有没有定量测浓度呢？跑的时候看到了溴酚蓝的颜色不代表真的有蛋白

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问做蛋白与蛋白免疫共沉淀时，前提必须得是使用高表达目的蛋白和诱饵蛋白的细胞株嘛？

Miracle星

免疫共沉淀既可以用于检验已知的两个蛋白质在体内的相互作用，也可以找出未知的蛋白质相互作用，不管是两者的哪个，其原则都是一样的，都需要用特异性的抗体与其中的一种蛋白质结合，之后通过蛋白质A或蛋白质G-琼脂糖微珠将复合物沉淀下来，然后用SDS-PAGE鉴定。免疫共沉淀中设置正确的对照非常重要，因为该方法可能出现假阳性的概率比较高，设置的对照包括：在对照组中使用对照抗体，以缺失目的蛋白的细胞系作为阴性

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问为什么用超滤膜包过滤出来的样品浑浊

天一湖医者

过滤后滤液仍然浑浊的原因1.滤纸破裂(1)玻璃棒下端紧靠在一层滤纸处，滤纸被戳破。(2)盛混合物的烧杯没有紧靠玻璃棒，滤纸被混合物冲破。2.混合物没有经过滤纸(1)液面高于滤纸边缘，混合物直接从滤纸和漏斗的间隙直接流下。(2)仪器不干净：漏斗下端不干净;下面收集滤液的烧杯不干净。

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问为什么用考马斯亮蓝法，空白值比样品吸光度值高

天一湖医者

出现这个情况可能是你的样品中的蛋白质含量确实很低，低过一定浓度时，结果就没有参考价值了。也有可能是考蓝工作液存放时间太久失效了，可以用一些蛋白标准品（比如BSA）来检验一下考蓝工作液是否正常。如果要用缓冲液做空白组的话，就用和蛋白样品一样的缓冲液就可以了

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问为啥我36kd出来的不好，而15kd出来的就好很多呢

bamboopiggy

不同的抗体，杂出来的条带形状会不一样，可能你15kd的抗体好

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问电源时有时溴酚蓝晕染特别厉害，都快超过1cm了，有时却很细，这是为什么？成分没换过。

Miracle星

我觉得是不均匀,重新配一下,换下缓冲液电泳缓冲液的问题：因为我以前跑双向的时候也遇到过此现象，后来换用新鲜的电泳缓冲液后溴酚兰就跑得成一条细细的直线了，原理不太清楚。2、分离胶内浓度不均：灌胶的时候胶要混匀，否则胶内浓度不均也会有此现象。3、分离胶凝固不均一：如玻板没洗干净，玻板在灌胶前用吹风吹干时没冷却至室温就灌胶，造成玻板内外温差等。不知正确与否，请大家多讨论。

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问为什么我跑出来的蛋白很圆?

天一湖医者

可能上样量没点好，PAGE胶凝的时间短。

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问跑wb,目的蛋白是p-p65，为何40附近的那条带明显

天一湖医者

原因：一抗非特异性与蛋白结合。解决办法：更换一抗。

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问非细胞提取物做wb如何选取内参

天一湖医者

样本的种属来源不同，内参的选择也是不一样的。哺乳动物的样本需要选择哺乳动物中稳定表达的蛋白作为内参；同样的，植物样本需要选择植物中稳定表达的蛋白做内参；

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问WB实验中，电转时出现条带弥散是怎么回事？

天一湖医者

可能是电场不均匀，尝试换转膜设备和缓冲液。

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问凯氏定氮法怎么去除掉非蛋白质氮？

天一湖医者

硫酸铜在碱性溶液中，可将蛋白质沉淀，且不溶于热水，过滤和洗涤后，可将纯蛋白质和非蛋白质含氮物分离，再用凯氏定氮法测定沉淀中的蛋白质含量。二、仪器设备（1）烧杯：200mL。（2）定性滤纸。（3）其它设备与粗蛋白质测定性相同。三、试剂及配制（1） 100g/L硫酸铜溶液：分析纯硫酸铜（CuSO4 5H2O）10g溶于100mL水中。（2） 25g/L氢氧化钠溶液：将2.5g分析纯氢氧

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问WB一直跑不出条带咋办

doczp1

先测一下浓度是不是太低啦？还有就是没有表达出来蛋白

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问已知基因序列如何在NCBI上面看蛋白质大小？

天一湖医者

首先打开NCBI网站首页，然后在search一栏中选择nucleotide，在框中输入你要的基因序列名称，点击search就行。然后会出来很多结果，因为很多基因是同名的，或是一个基因在不同种属中不一样，寻找你要的基因序列就行了。注意的是，要确定你的基因名称是否是统一的，我以前就是找一个基因费了很多事，之后发现是自己没有用通用的。找到基因序列，蛋白序列就很容易了，因为结果中会显示该基因的蛋白序列。你

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