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科研学霸天团,48小时有问必答
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求助|大家有用聚乙烯醇自己配抗淬灭封片剂的吗,请问所需溶剂及比例
bamboopiggy
配方包括:聚乙烯醇、甘油、重氮双环辛烷、金属离子螯合剂、碳酸盐缓冲液、Tris‑HCl缓冲液、防腐剂、水。这个现在很便宜,建议直接买了省事。
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问
THP-1诱导后消化
汤姆卜丽波
试试用胰酶加0.3-0.5%的EDTA,消化个七八分钟,拍一拍
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问
慢病毒感染THP-1后,细胞贴壁严重
dxy_giwowhk7
同学您好,我想问问你们现在这个问题解决了嘛?怎么解决的呀?我们现在也出现了这个问题?THP1一感染慢病毒就贴壁
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问
新手co-ip相关实验遇到的三个问题。希望能得到大佬的帮忙,万分感谢
汤姆卜丽波
input出不来可能是试剂准备上就有问题,也有可能蛋白不表达,而位置不同可能是收到了重链的干扰。避免干扰可以使用IPkine二抗,增加Input和IP泳道上样量,减少曝光时间,以及阴性对照IgG使用量建议调整到1ug以下。
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问
检测细胞自噬中相关蛋白表达量对于给药浓度的筛选如何设计实验
汤姆卜丽波
涉及到浓度的实验一般是采用梯度对照法,尽量控制变量在浓度上。也就是说细胞要是同一批次而且状态良好,无其他任何干扰项,以空白组为对照,设定浓度增量,每组增加一个梯度,控制时间,同一时间去检测。在这个基础上还可以做一个时间梯度。
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问
求WB大佬指导向下图这样子的蛋白条带改如何更改孵育条件,才能跑出来好看到的条带?
汤姆卜丽波
这种情况有可能是一抗浓度太高,导致抗体非特异性结合。降低一抗浓度。洗膜的时间和次数不够,导致其他蛋白没有清洗干净。提高洗脱时间和频率。封闭物用量不足。提高封闭物浓度,孵育时保证封闭液完全浸没转印膜。封闭物使用不当。检测生物素标记的蛋白时不可用脱脂奶粉封闭。封闭时间不够。室温37度封闭1小时以上,4度封闭过夜。一抗稀释度不适宜。对抗体进行滴度测试,选择最适宜的抗体稀释度。一抗孵育的温度偏高。建议4℃
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问
WB如何将β-actin内参做齐
balalaLy
蛋白定量不一定就很准的,最好是提蛋白的组织量或者细胞数相差不大的前提下做定量。
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问
WB中同一个电泳槽 两块板电泳速度不一致
whilt-shirt
电泳漏液会使电流过低,导致电泳速度下降
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问
wb实验有一组内参Gapdh爆不出来
balalaLy
其它样品都出来了,那就说明是样品本身的问题,蛋白量低,或者是你煮蛋白前忘记加蛋白了
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问
肺克 pfge 条带模糊跑不出来
天一湖医者
从这张图上看,加样孔不是太亮,你加的细菌的量可能有点少,就是细菌的浓度有点低,如果切开的话,很多条带也会很模糊;.可以设置对照孔,加酶和不加酶的,同时设置多组时间酶切,以节省时间;
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问
跑了两次wb,两次第4,5,6泳道都出现不同程度的扭曲和模糊,这是怎么回事啊?
balalaLy
1:胶的问题,可能玻璃板不行2:蛋白样品的问题,调整一下上样的位置,看看这三个样在其它位置会不会也是这样
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问
嘌呤霉素抑制蛋白合成实验
天一湖医者
嘌呤霉素的主要作用是抑制蛋白合成,这个不好验证。
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问
imageJ处理WB条带时,为什么要去背景?去背景的原理是什么?
balalaLy
imageJ读取的是所选区域的灰度值,如果不去背景,会干扰读取值,结果偏差会很大
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问
牛卵母细胞wb一抗好难找呀,买了几个都做不出条带 什么原因求大神指导!
汤姆卜丽波
可以看一看相关的文章,看看文章里的抗体是在哪里买的,问通讯也可以
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问
蛋白纯化过程中,37℃过夜摇菌产量不丰富,如果提高摇菌产量?
bamboopiggy
做预实验,确定到底是什么温度,什么转速,会影响你菌的产量,还有就是看你用的什么表达载体,不同得载体,摇菌的要求也不一样
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问
WB实验添加蛋白的量多少?
天一湖医者
Western blot实验中,蛋白上样没有特别固定的含量标准的。如果按照单一条带印染效果好来说的话,蛋白上样一般含量2~5微克就可以了。如果是表达提取总蛋白的话,为了让目的条带能够被检测到,总蛋白量可以提高一些,10~20微克都可以的。
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问
为什么GAPDH的分子量为146KD,但是检测条带为36KD左右??
汤姆卜丽波
GAPDH的检测条带就是约36KD,146KD是多聚体的大小
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问
co-ip igg组出现和目标条带相同位置 相同强度的条带,怀疑是igg或者磁珠结合了目的蛋白,更换igg可以吗?
汤姆卜丽波
可以啊,本来就应该是和ip同源的
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问
求问大佬们一个膜受体怎么影响另一个膜受体?
bamboopiggy
敲低你的这个受体看看,另外一个是否会增高,如果确定,说明二者之间确实有关系,你可以做ip或结构解析试试
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问
求助,TGF-B诱导HK-2转分化后,提蛋白跑a-SMA,正常组和模型组表达一样,非常齐
bamboopiggy
先找个阳参,说明你的药物好使,再回来讨论这个没有改变的问题吧
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