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问
IP实验阴性对照组IgG有目标条带,但是由于我的蛋白带有V5标签同时曝光V5阴性对照则没有条带,而用目的蛋白的抗体阴性对照有条带
balalaLy
可能是抗体非特异识别IgG,用标签蛋白就好了
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问
为什么会跑出说明书以外的很多杂带
Eason老歌迷
封闭时间不足。或者是你选的抗体特异性不高。
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问
荧光素酶实验用酶标仪测荧光的时候,直接用96孔板上机可以吗?需要特制的板吗?
bamboopiggy
不要用透明的细胞培养板,有那种不透明的黑色或白色的96孔板
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问
蛋白样品在冰箱零下20度最多可以保存多久?
天一湖医者
蛋白样品在冰箱零下20度最多可以保存一个月左右。
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问
新配制的一抗,孵出来蛋白条带只有细细的一条条带,形状像marker一样,不知道什么原因?
whilt-shirt
有可能是你的蛋白浓度太低,建议增加上样量
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问
电转两个半小时之后,分子量大的marker还在胶上,请问这是什么原因?
bamboopiggy
你转膜的条件是多少?反正400mA ,一小时10分钟左右,300kd的蛋白是可以转过去的
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问
酵母双杂交Y2H在四缺培养基上有自激活的话,意味着就是自激活吗?
Eason老歌迷
是的是的。一般检测自激活就是将已知基因构建到可以表达BD结合结构域的载体上,表达形成融合诱饵蛋白(bait),将目标基因构建到可以表达AD激活结构域的载体上,表达形成融合猎物蛋白(prey)。如果诱饵蛋白和猎物蛋白发生互作,BD结合结构域和AD激活结构域在空间上极为接近,GAL4转录因子发生重构,恢复了转录因子的功能,可以激活报告基因的表达。通过检测报告基因的表达与否,从而推测猎物蛋白和诱饵蛋白是
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问
WB内参还不错目的蛋白跑不出
bamboopiggy
首先要确定你的抗体好使,有阳参么?或者你可以试试孵育一个全膜,看看你的目的条带具体出在什么地方。
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问
wb目的蛋白不出条带
天一湖医者
没有出现目的条带,其常见的原因有两个:一是目的蛋白表达量过低,无法达到 WB 检测下限;二是在样品制备过程中,目的蛋白发生了丢失。
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问
求助wb不出条带
Ryan_J
我们用的都是实验专用的脱脂牛奶,还有二抗可以降低些,不知道你的推荐浓度是多少,二抗我都是1:10000
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问
真菌中的蛋白提蛋白过程中,留在上清的蛋白很少,通过WB甚至检测不出来,怎么做Coip?
秋秋欣欣
蛋白较少的还你就需要提高蛋白浓度,充分裂解,扩大真菌量
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问
请问慢病毒感染细胞24h后换液加抗生素筛选细胞大片脱落的原因是?
balalaLy
我一般是24小时如果状态太差就换液,换液后第二天才加抗生素。如果状态好就补几ml培养基继续培养到第二上午换液,下午加抗生素。如果还是死很多细胞说明转染失败,重新包病毒吧
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问
为什么有时候转完膜后mark大条带65KD以上的条带经常会花,扭曲,飘
bamboopiggy
蛋白呢?如果蛋白也这样,那是转膜没转好。如果蛋白没问题,那可能是你的marker降解了
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问
配完浓缩胶,本来还好好的,有时凝了一段时间后,孔和孔之间的胶突然出现泡泡,然后就塌了,尤其是最靠两边的孔慢慢的就塌了,为什么?
Eason老歌迷
首先浓缩胶它本来就会随着时间浓缩缩小。我感觉你这个可能还是有点漏,玻璃板密封性不佳?
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问
蛋白出现“笑脸”和“哭脸”条带的原因是为什么!
Eason老歌迷
出现笑脸哭脸的很大概率就是你制胶的时候没混匀。或者是电泳温度高了。
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问
western 电泳后前两块胶在marker 左侧又泳出了marker 条带,而后两块胶没有问题,电泳液都是现配后预冷
balalaLy
第一个孔什么都没加的话旁边的会溢散过来,所以最好是加适量的loading buffer
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问
如何可以调齐内参,总是调不齐,有什么好方法吗?
n0y0j7
首先测浓度测准,然后每次实验条件一样,包括电压电流,用的夹子,滤纸张数,等。
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问
从超声纯化的蛋白怎么保存,可以放在负二十吗,可以放多久,如果制成wb的上样品,需要怎么保存?
天一湖医者
可以。1. 短期保存(24 小时内)大多数的蛋白质可以保存在 4°C。2. 在 4°C 超过 24 小时 需要考虑对蛋白样品灭菌过滤(使用 0.22 µm 过滤器),或者加入抑菌剂(例如 0.1% 叠氮化钠)以避免细菌生长。值得注意的是,并非所有蛋白质都能在 4°C 长时间保持稳定。3. 长期保存(一周以上)需要将蛋白样品冻存。
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问
关于WB电泳的若干疑问
Eason老歌迷
第一个问题,我用过预制胶和自己配的胶,我个人还是更喜欢用自己配的,感觉效果更好,当然前提是你一定要混匀。第二个问题,小蛋白在转膜时一定要注意控制时间。一般湿转半个小时即可。
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问
wb中的磷酸化蛋白要怎么跑,有没有什么特殊技巧,能跑的好看
秋秋欣欣
磷酸化的蛋白封闭的时候最好用5%BSA
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