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转膜后,如何选择抗体,敷抗体的时间怎么把握?
Eason老歌迷
根据你跑的目的蛋白选择一抗,然后二抗的话就根据你选的一抗种属来选择,一抗是鼠的就选抗鼠,一抗是兔的就选抗兔。一抗一般都是4℃孵育过夜。然后二抗常温孵育1.5h,别孵育太久。你可以做几次预实验,调整一下孵育时间,看看什么时间最合适。
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问
BCA法蛋白定量后,内参条带仍然不齐,怎么办?
蜡笔小迟
组织定量本来靠测浓度就不准,建议:先测浓度,按浓度跑内参,然后按内参灰度调整上样量。
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问
蛋白显影拍出来黑乎乎,不明显是什么原因?
Eason老歌迷
可能是你的封闭时间太短了。也可能是你的抗体浓度太高了,或者孵育时间太长了。
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问
为什么有时候WB显影出来的结果跟说明书上的不同?
Eason老歌迷
因为实验条件不一样,肯定会有或多或少的差别,只要不是太大就行。
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问
加入碧云天5x上缓冲液变性后,上样会漂样怎么办?
笋干CAU
我之前电泳缓冲液忘了稀释直接用的5x 样品就漂起来了
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问
目前脱脂奶粉封闭,条带背景不是很干净,封闭时究竟是选脱脂奶粉、BSA还是商品化的快速封闭液更好呢?
Eason老歌迷
我觉得脱脂奶粉效果更好,你可以封闭时间长一点,这样会更干净。
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问
为什么同一个指标,不同公司的抗体条带位置不一样,有四十几,有五十几版本,如果两个抗体一起孵,不得有两个目的条带吗?
Eason老歌迷
不同公司的抗体,肯定是多多少少有点不一样。如果你两个抗体一起孵,不会有两个条带,但是可能会有一个宽的连在一起的条带。
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问
IP实验阴性对照组IgG有目标条带,但是由于我的蛋白带有V5标签同时曝光V5阴性对照则没有条带,而用目的蛋白的抗体阴性对照有条带
balalaLy
可能是抗体非特异识别IgG,用标签蛋白就好了
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问
为什么会跑出说明书以外的很多杂带
Eason老歌迷
封闭时间不足。或者是你选的抗体特异性不高。
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问
荧光素酶实验用酶标仪测荧光的时候,直接用96孔板上机可以吗?需要特制的板吗?
bamboopiggy
不要用透明的细胞培养板,有那种不透明的黑色或白色的96孔板
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问
蛋白样品在冰箱零下20度最多可以保存多久?
天一湖医者
蛋白样品在冰箱零下20度最多可以保存一个月左右。
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问
新配制的一抗,孵出来蛋白条带只有细细的一条条带,形状像marker一样,不知道什么原因?
whilt-shirt
有可能是你的蛋白浓度太低,建议增加上样量
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问
电转两个半小时之后,分子量大的marker还在胶上,请问这是什么原因?
bamboopiggy
你转膜的条件是多少?反正400mA ,一小时10分钟左右,300kd的蛋白是可以转过去的
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问
酵母双杂交Y2H在四缺培养基上有自激活的话,意味着就是自激活吗?
Eason老歌迷
是的是的。一般检测自激活就是将已知基因构建到可以表达BD结合结构域的载体上,表达形成融合诱饵蛋白(bait),将目标基因构建到可以表达AD激活结构域的载体上,表达形成融合猎物蛋白(prey)。如果诱饵蛋白和猎物蛋白发生互作,BD结合结构域和AD激活结构域在空间上极为接近,GAL4转录因子发生重构,恢复了转录因子的功能,可以激活报告基因的表达。通过检测报告基因的表达与否,从而推测猎物蛋白和诱饵蛋白是
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问
WB内参还不错目的蛋白跑不出
bamboopiggy
首先要确定你的抗体好使,有阳参么?或者你可以试试孵育一个全膜,看看你的目的条带具体出在什么地方。
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问
wb目的蛋白不出条带
天一湖医者
没有出现目的条带,其常见的原因有两个:一是目的蛋白表达量过低,无法达到 WB 检测下限;二是在样品制备过程中,目的蛋白发生了丢失。
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问
求助wb不出条带
Ryan_J
我们用的都是实验专用的脱脂牛奶,还有二抗可以降低些,不知道你的推荐浓度是多少,二抗我都是1:10000
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问
真菌中的蛋白提蛋白过程中,留在上清的蛋白很少,通过WB甚至检测不出来,怎么做Coip?
秋秋欣欣
蛋白较少的还你就需要提高蛋白浓度,充分裂解,扩大真菌量
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问
请问慢病毒感染细胞24h后换液加抗生素筛选细胞大片脱落的原因是?
balalaLy
我一般是24小时如果状态太差就换液,换液后第二天才加抗生素。如果状态好就补几ml培养基继续培养到第二上午换液,下午加抗生素。如果还是死很多细胞说明转染失败,重新包病毒吧
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问
为什么有时候转完膜后mark大条带65KD以上的条带经常会花,扭曲,飘
bamboopiggy
蛋白呢?如果蛋白也这样,那是转膜没转好。如果蛋白没问题,那可能是你的marker降解了
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