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求助|活化的b细胞形态正常吗?
Eason老歌迷
感觉还行,还是有一些活化的细胞存在,但是形态不是太好。
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问
wb:500多kda的大分子怎么跑
天一湖医者
选对凝胶很重要 3种最常见的凝胶包括Tris-Glycine, Bis-Tris and Tris-Acetate. Tris-Glycine凝胶的PH为8.6,且保质期很短。在跑胶的过程中,PH还有上升的趋势,可达到9.5。这会导致蛋白降解和低分辨率。 Bis-Tris凝胶的PH为6.4,相对Tris-Glycine凝胶,稳定性和保质期都有所增加。但这种凝胶需要在溶液中增加抗氧化剂,比如DTT
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问
WB曝光时间为什么不一样
Eason老歌迷
没事,正常现象,wb显影可以据信号的强弱适当调整曝光时间,你选一个显影效果最佳的时间即可。可能是你的抗体用时间长了的问题,或者你没有放-20℃保存好
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问
做WB,核蛋白跑不进分离胶是怎么回事啊
whilt-shirt
有可能是电泳液的原因,建议重新配置电泳液
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问
为什么western的内参调齐了一次之后,再按齐的上样量跑actin又不齐了
yanlai000
确定上样量一致,转膜条件一致,换配胶方式有可能会有这种情况
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问
WB条带问题分析
Eason老歌迷
可能是你的样品问题,比如说你没有在冰上裂解,蛋白降解了。也可能是你的胶切错了,把目的条带切掉了。一抗二抗混了,没有孵育好。
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问
蛋白质拓扑结构示意图绘制
bamboopiggy
这个可以用AI,自己画,如果你已经知道你的蛋白的结构的话
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问
角蛋白10和细胞角蛋白10
Eason老歌迷
是的,细胞角蛋白10是分子量56.5KD的①型细胞角蛋白。
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问
WB出现奇怪的线性条带
麻黄连翘赤小豆
多克隆抗体也可能这样,特异性较差
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问
Wb‖条带粗怎么办?
whilt-shirt
有可能是上样量过高,建议减少上样量试试
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问
求助:用了新的蛋白上样缓冲液后,SDS没有条带
冷泉港蛋白
需要知道上样缓冲液各组分及其浓度和特点,undefined上样含有4 %的sds,四度会结晶,需要恢复室温并混匀后使用。你加的上样缓冲液估计不含或含有很少的sds,不足以解离细胞或提供蛋白前进所需要的负电荷了。
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问
求助|flag-beads是自带抗性吗?
bamboopiggy
对,flag-beads是自带flag抗体的beads,你只要binding完了,煮了以后,要先用flag的一抗去杂,加二抗显影就可以。
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问
HIF-1α蛋白纯化!!!
Eason老歌迷
做过,可以做出来。但是吧,GST融合蛋白容易氧化形成二聚体,影响纯化效果,所以经常会在结合及洗脱缓冲液中添加1-10mM DTT,效果才会好。
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问
低丰度蛋白跑western blot
whilt-shirt
增加上样量至10-20ul,一抗稀释比例提高到1:500试试
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问
小鼠血清能用PBS稀释吗?
whilt-shirt
PBS是等渗溶液,理论上是可以的
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问
WB.结果分析
whilt-shirt
应该是数据之间差异比较大,建议调整曝光时间使条带颜色差不多试试
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问
融合蛋白结构域连接可以嘛?
bamboopiggy
还是要用linker的,直接融合会影响蛋白的折叠
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问
最近在做毕赤酵母蛋白诱导,总是失败?
Eason老歌迷
可能是有几个原因。如果用GS115表达不出蛋白,我们换成KM71H后,大部分克隆能表达。 我们尝试过在28度和室温下诱导表达,表达水平可能都不低。ph的话就选择用6.0——6.8,BMMY的pH7.0-7.5比较合适。
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问
蛋白纯化时发现沉淀出现问题?
Eason老歌迷
硫酸铵沉淀是很粗的分级方法,建议你精纯的话还是要过柱子的。
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问
原核诱导蛋白,相关问题求助?
Eason老歌迷
诱导的蛋白只在沉淀中,上清中没有,这个现象很正常,我也遇到过。你可以提前去biotech上查看预测蛋白可溶性问题。在或者看你的外源蛋白是否含有稀有密码子,如果有的话建议使用Rosetta表达菌株。
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