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科研学霸天团,48小时有问必答
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融合蛋白提问
bamboopiggy
你最好是在n端连GFP或者则就是c端去掉跨膜区以后,连GFP,否则,GFP可能检测不到。
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问
ip实验
冷泉港蛋白
你搜下,之前讨论过相关问题。涉及到蛋白互作研究的几个层次
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问
酶联免疫试剂盒检测细胞培养上清中的酪蛋白浓度时,若样本中酪蛋白浓度太低,怎样将样本浓缩?
麻黄连翘赤小豆
蛋白浓度低一般都没办法浓缩吧,除非和蛋白浓度高的样本混合
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问
磷酸化AKT WB实验复孔结果差异大
bamboopiggy
wb只要趋势一致就可以,不能要求量一定一样,因为跑胶,转膜,封抗体等,都会造成影响。
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问
血清离心上层分层,但是吸取的会带有红色的血
bamboopiggy
3000rpm 5min就够了,或者1000rpm 10min,你说的上层有血,应该是红细胞破了。看你要做什么实验了,有的红细胞破了没影响,有的不行。
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问
在进行底物TMB溶液显色后,酶标板中的孔有颜色但没有梯度,背景较高,常见原因有哪些?
此用户已注销
出现该现象的可能原因有底物溶液TMB未置于阴凉避光处保存,实验前溶液已经变蓝。孵育温度过高或者孵育时间过长,发生了较强的非特异性吸附。没有按说明书要求洗板,特别是洗板时洗涤液的量少加了。加样时没有换枪头造成交叉污染。
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问
免疫共沉淀怎么才能去除IgG重链和轻链的条带?
冷泉港蛋白
1.首先看下原理:你可以选择原理二的试剂盒,看看是否可以解决你的问题2.调整胶浓度,或更换其他缓冲体系的PAGE,使轻链与目的条带分离开。3.就是调整抗体的种属了,不讨论了。4.应该有那样一种二抗,与变性的一抗不反应,只与天然的一抗反应,市场应该有吧?
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问
做wb,pcr 实验,解剖后新鲜组织可以先放-20度再转移到-80度吗?
bamboopiggy
最好直接放-80,速冻,否则组织容易降解。
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问
请问跑wb,pcr 需要多少组织量呢?
bamboopiggy
wb你最好测个蛋白浓度,20-40ug的上样量就可以,pcr,只要够提dna的就可以,大概绿豆到黄豆大小吧
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问
变性蛋白和非变性蛋白,哪个保存的更久
bamboopiggy
最好是变性,非变性的更容易降解。
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问
elisa实验可以用超纯水可替代双蒸水吗?
bamboopiggy
你说的超纯水是miliQ水么?是可以的。只要不含杂质和盐就可以。
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问
10%的预制胶,这条带是不是典型的哑铃型?求解决?后面反白跟封闭有关系吗?
bamboopiggy
用预制胶,要把梳子齿里的甘油冲干净,否则会影响上样的样子。反白,可能是你抗体浓度太大,或蛋白浓度太高,导致辣根过氧化酶反应太强,出现的烧心现象。
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问
小白想问问各位老师GAPDH分子量为140kDa,检测条带在37kDa是什么意思呢
你好几和户
因为细胞质GAPDH 主要以四聚体形式存在。这种形式由四个相同的 37- kDa亚基组成。
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问
请问ELISA试剂盒检测MAC-T饥饿处理后的细胞培养上清,为什么无法计算出酪蛋白浓度?
冷泉港蛋白
是不是试剂盒有问题?1.查下你买的试剂盒是否有引用文献 2.做个wb看下,抗体应该不贵
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问
血清离心需要4度吗?转速时间是多少呢
Eason老歌迷
血清离心不需要4℃,转速3000-3500,三分钟即可。
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问
求助WB内参不齐,如何解决?
Eason老歌迷
如果内参没有选择错误,而只是内参不齐的话,那说明你的蛋白定量有问题,只需要根据内参的IOD做一下上样量的调整就可以了。
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问
HA标签有9个氨基酸构成如果只插入前7个氨基酸能曝出来吗?
bamboopiggy
看HA抗体的都是用九个氨基酸的短肽去免疫动物获得的,你可以申请试用装试试,可能能曝出来。
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问
一抗用鼠抗还是兔抗?
Eason老歌迷
一般我们都不裁膜了,可以按照你的这样做法来做,我觉得可行。
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问
IP实验
转云511
说明你的目的蛋白在野生型的细胞里也有表达,但是表达量很低。过表达的细胞里,目的蛋白表达量多。IP后,可以看到很明显的,过表达的蛋白条带要比野生型的条带粗的多。野生型在这里可作为对照,一个目地是看你的方法对不对,方法对的话,野生型是有条带的,要是没条带,说明IP的步骤有问题;另外一个目地是看,你的过表达细胞是不是目的蛋白真的过表达了,从条带的粗细可以看出来。
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问
第一张WB条带为什么会这样子?有没有大佬解决一下
Eason老歌迷
下面图的条带还行了。上面图这个看着像是上样量太大了,或者是你选的抗体特异性不高。
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