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        关于RNase R和放线菌素D有没有必要做?

        相关实验:用T4 RNA 连接酶连接 RNA 分子

        user-title

        dxy_scogg4dw

        请教各位大佬,我是做circRNA的相关课题,想请教一下RNase R和放线菌素D有没有必要做?还是说设计好引物做PCR检测就可以了呢?主要是这两种试剂单纯只为了验证环装的话有点太贵了…

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        5 个回答

        user-title

        沉沦6RZH

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        你好,我也想做circ,最后你在验证成环方面做了哪些实验?只有qpcr吗?

        user-title

        loveliufudan

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        在验证cirRNA的时候,RNase R处理与聚乙烯醇沉淀确实是常用的方法,但进行这两项实验可能需要一定的成本,以下是一些建议:


        1. 如果仅为了验证cirRNA的环型结构,设计环内和环外引物进行PCR验证也是可以的。确保引物跨断环结点。


        2. 可以只做RNase R处理实验,因为其可以降解线性RNA而不影响环型RNA,可以验证cirRNA的环形性质。


        3. 不一定需要聚乙烯醇沉淀实验,该实验主要是提供cirRNA存在于细胞质而不是细胞核的证据。如果定位不是研究重点可以省略。


        4. 建议做Northern blot实验,以完整band证实cirRNA的存在,该方法成本较低。


        5. 如果条件允许,测序或RACE实验可以确定cirRNA的结构,但成本也较高。


        6. 综合各种验证结果,即可证实cirRNA的存在。如果资源有限,可以只做RNase R处理和PCR验证。

        user-title

        此用户已注销

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        有必要,实验步骤


        1.RNA 提取:


        ①样品处理:组织样品准备,细胞样品准备 ②RNA 提取


        ③总 RNA 定量


        ④circRNA 的预处理:去除核糖体 RNA 和 poly-A RNA


        2.RNAase R 酶消化


        (RNase R 是一类核糖核酸外切酶,能降解大部分线性 RNA,但 circRNA 不易被 RNase R酶消化降解。因此可以通过该实验鉴别 circRNA 和线性 RNA。)


        ①准备总 RNA 样品


        ②RNase R 反应体系


        3.放线菌素 D 实验


        (circRNA 半衰期一般比线性 RNA 长、稳定性更好。放线菌素 D 能抑制 RNA 的转录,可以利用放线菌素D处理细胞,检测细胞中 circRNA 和同源线性基因的含量,可反映circRNA 和线性 RNA 的半衰期和稳定性。)


        4.证明成环实验:


        ①circRNA 高通量测序


        ②Northern Blot:制备尿素-丙烯酰胺变性胶;探针制备;杂交实验


        • ③发散引物 RT-PCR
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        于小鱼鱼1998

        有帮助

        设计好引物需要做一个pcr.放线菌素没有条件可以不做

        user-title

        此用户已注销

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        RNaseR和放线菌素D有条件可以做一下,没有的话设计好引物做PCR检测就可以了

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