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        【求助】RNA浓度差不多的情况下,U6作为内参,Ct值差4,可能吗

        丁香园论坛

        9203
        找公司做real-time PCR验证miRNA,报告上两个RNA浓度差不多
        样品编号 OD260 OD280 OD260 / OD280 OD260 / OD230 浓度(ng / µl)
        1 41.511 20.442 2.03 2.29 1660.45
        2 34.937 16.922 2.06 2.08 1397.47
        但U6内参Ct值相差4左右,1号为16左右,2号为11左右

        要说明的是,1号和2号都是取得小鼠脑组织,虽然一号小鼠是某基因敲除的,但基本上生理功能都不受什么影响的,总不能真的体内的U6本身表达就降了如此多吧,U6不是公认的内参吗?其他待检的miRNA也是Ct值也是差了很多(5-6的样子),我不知道这样扣除U6的话,得到的结果可不可靠。请高手指教!
        不可靠。Ct值相差这么多,没有统计意义
        我也遇到了这样的情况,那会是什么原因?怎么处理?
        程小妖 wrote:
        我也遇到了这样的情况,那会是什么原因?怎么处理?
        你遇到这样的情况,是你自己实验做得,还是公司做的?
        上次我提的问题,后来据我自己估计,公司有问题的可能性较大,后来已不再公司做服务,而是自己来做了。
        biowind wrote:
        你遇到这样的情况,是你自己实验做得,还是公司做的?
        上次我提的问题,后来据我自己估计,公司有问题的可能性较大,后来已不再公司做服务,而是自己来做了。
        我自己做的,但是是公司提的mirRNA,我做了两遍,每次三个平行,结果都是RNA浓度高的反而Ct值大,会不会是U6不适合做内参?还是其他什么原因?
        确实有U6不适合做内参的情况,有文献专门讨论过这个问题。就像GAPDH并非在所有实验条件下都适合做内参一样。所以要是你自己确实得到这样的结果,我建议你改用5srRNA 内参试一试,如果依然这样,那还真可能公司提取miRNA时出了问题。
        一般来讲u6做内参还是可以的,多数CT值相差大是由于提取过程造成的。
        如果做过短链RNA富集的话,U6的CT值就没有参考意义。
        原因是:市面的RNA富集柱富集的都是200bp以下短链RNA,而U6不是真正意义的MicroRNA,其长度刚好卡在这个值上,会造成提取中的损失。
        另外,可以在提取中添加外源序列,比如线虫或者拟南芥的microRNA,作为参照,这样可以看看是否是由于提取造成的损失。

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