【求助】RNA浓度差不多的情况下，U6作为内参，Ct值差4，可能吗
丁香园论坛
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找公司做real-time PCR验证miRNA，报告上两个RNA浓度差不多
样品编号 OD260 OD280 OD260 / OD280 OD260 / OD230 浓度（ng / µl）
1 41.511 20.442 2.03 2.29 1660.45
2 34.937 16.922 2.06 2.08 1397.47
但U6内参Ct值相差4左右，1号为16左右，2号为11左右
要说明的是，1号和2号都是取得小鼠脑组织，虽然一号小鼠是某基因敲除的，但基本上生理功能都不受什么影响的，总不能真的体内的U6本身表达就降了如此多吧，U6不是公认的内参吗？其他待检的miRNA也是Ct值也是差了很多（5－6的样子），我不知道这样扣除U6的话，得到的结果可不可靠。请高手指教！
样品编号 OD260 OD280 OD260 / OD280 OD260 / OD230 浓度（ng / µl）
1 41.511 20.442 2.03 2.29 1660.45
2 34.937 16.922 2.06 2.08 1397.47
但U6内参Ct值相差4左右，1号为16左右，2号为11左右
要说明的是，1号和2号都是取得小鼠脑组织，虽然一号小鼠是某基因敲除的，但基本上生理功能都不受什么影响的，总不能真的体内的U6本身表达就降了如此多吧，U6不是公认的内参吗？其他待检的miRNA也是Ct值也是差了很多（5－6的样子），我不知道这样扣除U6的话，得到的结果可不可靠。请高手指教！
不可靠。Ct值相差这么多，没有统计意义
我也遇到了这样的情况，那会是什么原因？怎么处理？
程小妖 wrote:
我也遇到了这样的情况，那会是什么原因？怎么处理？
上次我提的问题，后来据我自己估计，公司有问题的可能性较大，后来已不再公司做服务，而是自己来做了。
biowind wrote:
你遇到这样的情况，是你自己实验做得，还是公司做的？
上次我提的问题，后来据我自己估计，公司有问题的可能性较大，后来已不再公司做服务，而是自己来做了。
确实有U6不适合做内参的情况，有文献专门讨论过这个问题。就像GAPDH并非在所有实验条件下都适合做内参一样。所以要是你自己确实得到这样的结果，我建议你改用5srRNA 内参试一试，如果依然这样，那还真可能公司提取miRNA时出了问题。
一般来讲u6做内参还是可以的，多数CT值相差大是由于提取过程造成的。
如果做过短链RNA富集的话，U6的CT值就没有参考意义。
原因是：市面的RNA富集柱富集的都是200bp以下短链RNA，而U6不是真正意义的MicroRNA，其长度刚好卡在这个值上，会造成提取中的损失。
另外，可以在提取中添加外源序列，比如线虫或者拟南芥的microRNA，作为参照，这样可以看看是否是由于提取造成的损失。
如果做过短链RNA富集的话，U6的CT值就没有参考意义。
原因是：市面的RNA富集柱富集的都是200bp以下短链RNA，而U6不是真正意义的MicroRNA，其长度刚好卡在这个值上，会造成提取中的损失。
另外，可以在提取中添加外源序列，比如线虫或者拟南芥的microRNA，作为参照，这样可以看看是否是由于提取造成的损失。
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