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        求助|鼠尾鉴定出现非特异条带怎么办?

        相关实验:甲基化特异PCR

        user-title

        dxy_dpvveli7

        近期购进4只敲基因小鼠,鼠尾鉴定结果如下,WT为野生型对照,B为空白对照,引物1条带正常,引物2四只鼠均出现了不应该出现的一条带,尝试升高退火温度仍无法消除,有没有小伙伴知道是什么原因以及如何消除这条非特异条带呢?图片描述图片描述

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        4 个回答

        user-title

        balalaLy

        有帮助

        如果购买的敲除鼠,那你的引物以及pcr程序都是公司鉴定过给到你的。那么出问题的大概率应该就是pcr试剂或者引物保存问题。

        user-title

        dxyc42u

        有帮助

        可能引物设计的不好而出现了非特异性条带,重新设计引物

        user-title

        loveliufudan

        有帮助

        可能有以下几个原因和解决方法:

        1. 引物非特异性:引物2可能存在非特异性扩增,导致额外的条带出现。您可以通过以下几种方法来解决:

        • 设计新的引物:重新设计特异性更高的引物,确保它们只扩增目标序列。

        • 优化PCR条件:尝试不同的退火温度、引物浓度和PCR循环数等参数,以优化特异性和减少非特异性扩增。

        2. 引物杂交:引物可能与鼠尾DNA中的非特定序列发生杂交,导致附加的条带出现。为了解决这个问题,您可以尝试以下方法:

        • 优化退火温度和延长退火时间:适当调整退火温度和延长退火时间,以增强引物的特异性结合。

        • 增加DNA解旋剂:添加DNA解旋剂(如二甲基亚硫酸钠)到PCR反应中,以帮助降低引物与非特定序列的杂交。

        3. 引物与其他目标扩增:引物2可能与其他未预期的目标序列发生扩增,导致额外的条带出现。为了解决这个问题,可以尝试以下方法:

        • 提取和纯化目标序列:使用特异性的方法,如聚合酶链反应(PCR)或基因克隆,提取和纯化目标序列,以避免非特定序列的扩增。

        • 使用其他引物或探针:尝试使用其他引物或探针,以提高特异性并避免非特定扩增。

        user-title

        土井挞克树

        有帮助

        更换引物吧,可能是引物特异度差导致的

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